大家好，今天和大家分享的是2020年3月發(fā)表在Mathematical Biosciences and Engineering （IF＝1．285）上的一篇文章：“Screening and validating the immune－related gene expression signatures in peripheral blood mononuclear cells of nonischaemic cardiomyopathy”。作者通過簡單的差異基因篩選，富集分析，PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及動物實驗探討了與非缺血性心肌病中外周血單個核細胞失調(diào)相關(guān)的免疫基因表達以及基因間的聯(lián)系。

Screening and validating the immune－related gene expression signatures in peripheral blood mononuclear cells of nonischaemic cardiomyopathy

非缺血性心肌病外周血單核細胞免疫相關(guān)基因表達特征的篩選與驗證

一、研究背景

已有大量的證據(jù)表明，激活的免疫反應(yīng)可引起心肌不良的重構(gòu)，而非缺血性心肌病患者外周血單個核細胞的失調(diào)也被證實與患者預(yù)后存在相關(guān)。作者希望在本研究中篩選并驗證PBMC的相關(guān)生物標志物并探討其影響患者預(yù)后可能的機制。

二、研究流程

三、結(jié)果解析

1．差異表達基因篩選

在本研究中，作者使用GEO2R在線分析工具對GEO數(shù)據(jù)庫中3個健康樣本和4個NICM樣本PBMC的轉(zhuǎn)錄情況進行了比較。在對GSE9128的芯片數(shù)據(jù)進行分析后，作者共篩選得到371個DEG（P＜0．05，｜logFC｜≥1，288上調(diào)，83下調(diào)，圖1A）。熱圖中展示了Top10上調(diào)和Top10下調(diào)的DEG的表達情況（圖1B）。在這371個DEG中，Top5上調(diào)以及Top5下調(diào)的DEG的相關(guān)信息展示于表1。

圖1A．健康樣本與NICM樣本的DEG；圖1B．Top5上調(diào)和下調(diào)DEG在不同樣本中的表達情況

表1．Top5上調(diào)／下調(diào)基因的相關(guān)信息

2．GO與KEGG富集分析

為深入了解上述DEG，作者使用DAVID數(shù)據(jù)庫及配套工具進行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)在生物過程層面，上調(diào)的DEG主要富集于炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、細胞對機械刺激的反應(yīng)和翻譯過程的負向調(diào)控，而下調(diào)的DEG則富集于基因表達的晝夜調(diào)節(jié)、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的負調(diào)控、天然免疫反應(yīng)、細胞對過氧化氫的反應(yīng)和I－κB激酶／NF－κB信號的負調(diào)控。對于細胞組成來說，上調(diào)的DEG主要富集在胞外外泌體，細胞核，膜以及核質(zhì)和胞漿中，而下調(diào)的DEG則富集在細胞核，核質(zhì)，中心體和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物中。在分子功能層面，上調(diào)的DEG主要負責(zé)ATP結(jié)合、poly（A）RNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、核苷酸結(jié)合和GTP結(jié)合，而下調(diào)的DEG可能在蛋白質(zhì)結(jié)合、線粒體解偶聯(lián)和細胞因子活性方面發(fā)揮作用。

為了獲得關(guān)于上述DEG的更多相關(guān)信息，作者還通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行了KEGG富集分析（圖2D）。發(fā)現(xiàn)下調(diào)的DEG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、軍團菌、NF－κB信號通路、NOD樣受體信號通路、雌激素信號通路中富集，而上調(diào)的DEG在炎癥性腸�。↖BD）、TGF－β信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路和EB病毒感染中富集。

圖2A－C．對DEG進行的GO富集分析結(jié)果展示；圖2D．對DEG進行的KEGG富集分析結(jié)果

3．樞紐基因和代表性模塊的探索

此外，作者通過Cytoscape軟件分析發(fā)現(xiàn)15個樞紐基因處于蛋白－蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心位置，這些基因互相存在密切聯(lián)系。作者基于公共數(shù)據(jù)庫STRING和上述15個樞紐基因構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。在這15個樞紐基因中，只有一個基因在NICM患者的PBMC中顯著下調(diào)，而其他基因在PBMC中顯著上調(diào)。值得注意的是，JUN不僅是與其它蛋白互作關(guān)系強度最高的DEG，還是fold change最高的下調(diào)DEG。此外，這15個樞紐基因可以直接與371個中的149個DEG相互作用，樞紐基因之間也有相互作用，尤其是JUN和CREB1。此外，作者還使用MCODE插件來檢測PPI網(wǎng)絡(luò)中的功能模塊并確定了評分值最高的前2個模塊——模塊1（圖3B）與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的免疫反應(yīng)和蛋白質(zhì)加工有關(guān)，模塊2（圖3C）與炎癥的信號通路和細胞反應(yīng)有關(guān)。總的來說，PPI網(wǎng)絡(luò)表明，上述15個樞紐基因，特別是JUN和CREB，可能在NICM的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

圖3A．通過Cytoscape軟件進行的PPI分析結(jié)果（圖示15個樞紐基因）；圖3B，C．PPI網(wǎng)絡(luò)中的兩個評分最高的功能模塊

4．異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠模型中基因的驗證

為了進一步確證GSE9128芯片的數(shù)據(jù)并進行進一步的研究，作者通過qPCR在異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損害的小鼠模型中重新鑒定了Top5上調(diào)基因和Top5下調(diào)基因（圖4）。qPCR結(jié)果表明，NICM小鼠PBMC中EGR3、MBNL1、PTGS2、EGR2和TXNIP的mRNA表達水平明顯高于對照組（P＜0．05），而NICM組GABARAPL3、NPIPB3、RGS1、CREM和JUN的mRNA表達水平明顯低于對照組（P＜0．05），與通過生信分析得出的DEG結(jié)果相互印證。

圖4．在異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損害的小鼠模型中測定前文中Top5上調(diào)基因和Top5下調(diào)基因的表達情況

5．探討PBMC亞型中DEG的表達情況

此外，作者還檢測了PBMC亞型中Top5上調(diào)基因和Top5下調(diào)基因的mRNA水平。目前已知PBMC主要包括T細胞、B細胞和單核細胞。因此，作者主要探討了這10個基因在CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、CD14＋單核細胞和CD20＋B細胞中的mRNA水平（圖5）。發(fā)現(xiàn)EGR3主要在NICM小鼠T細胞中表達。單核細胞中MBNL、PTGS2和EGR2均較高，而NICM小鼠的表達明顯較高。TXNIP主要表達于CD4＋T細胞，CD8＋T細胞和CD20＋B細胞，在NICM存在下其表達顯著增加。關(guān)于下調(diào)基因，作者發(fā)現(xiàn)JUN在正常受試者的T細胞中高表達，而在NICM小鼠的T細胞中其水平降低，但在B細胞中增加。CREM主要在T細胞中表達，而NICM小鼠T細胞中CREM水平降低。RGS1主要在正常小鼠的B細胞中表達。與NICM小鼠相比，正常小鼠T細胞和單核細胞NPIPB3水平較高。四種免疫細胞中GABARAPL3的mRNA水平在正常小鼠中始終高于NICM小鼠。

圖5．前文篩得的Top5上調(diào)基因和Top5下調(diào)基因的mRNA水平

小結(jié)

       作者將常用于腫瘤學(xué)的DEG篩選、GO和KEGG富集分析以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測等方法應(yīng)用于非缺血性心肌病的相關(guān)研究，并且進行了動物實驗進行驗證，可以說是較為成熟的干濕實驗結(jié)合套路，但作者將前述套路套用到非缺血性心肌病外周血單個核細胞失調(diào)的研究中，思路新穎。不過作者在文章中并未對某一具體通路進行探究，具體的相關(guān)機制還有很大的挖掘空間。