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前言

免疫療法的巨大進(jìn)展改變了目前癌癥治療的模式，然而，鑒于只有少數(shù)患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷和其他免疫治療策略有響應(yīng)，因此需要更多新技術(shù)來破譯腫瘤細(xì)胞與腫瘤免疫微環(huán)境（TME）成分之間復(fù)雜的相互作用。

腫瘤免疫組學(xué)是指利用免疫基因組學(xué)、免疫蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫生物信息學(xué)等反映腫瘤免疫狀態(tài)的多組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)TME進(jìn)行的綜合研究，它依賴于下一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展。高通量基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可用于計(jì)算免疫細(xì)胞的豐度和預(yù)測(cè)腫瘤抗原，然而，由于批量測(cè)序代表了異質(zhì)細(xì)胞群的平均特征，因此無法區(qū)分不同的細(xì)胞亞型�；�于單細(xì)胞的技術(shù)能夠通過精確的免疫細(xì)胞亞群和空間結(jié)構(gòu)研究更好地解析TME。此外，基于放射組學(xué)和數(shù)字病理學(xué)的深度學(xué)習(xí)模型在很大程度上有助于腫瘤免疫的研究，這些人工智能技術(shù)在預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)方面表現(xiàn)良好。這些新技術(shù)的進(jìn)展和突破對(duì)癌癥治療具有深遠(yuǎn)意義。

腫瘤免疫微環(huán)境

在過去幾年中對(duì)腫瘤免疫的研究進(jìn)展，使我們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)發(fā)生了根本的改變。腫瘤的定義也從單純的腫瘤細(xì)胞聚集演變?yōu)橐粋�(gè)復(fù)雜的器官樣結(jié)構(gòu)，由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和周圍的其他基質(zhì)細(xì)胞組成。腫瘤附近的各種細(xì)胞和成分，如免疫浸潤(rùn)細(xì)胞、血管，細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，也稱為腫瘤免疫微環(huán)境，已成為腫瘤學(xué)最熱門的研究課題之一。TME已被證明在癌癥發(fā)生、腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著決定性的作用。

TME包含了極其多樣的免疫細(xì)胞亞群，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、粒細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）等。通常，T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有助于抑制腫瘤生長(zhǎng)，而MDSC和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）傾向于抑制抗腫瘤免疫。然而，現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，鑒于與腫瘤細(xì)胞的復(fù)雜相互作用，免疫細(xì)胞的特定作用可能會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，甚至變得完全相反。

總之，各種各樣的免疫細(xì)胞類型，甚至特定免疫細(xì)胞類型的不同功能狀態(tài)都可能對(duì)抗腫瘤免疫產(chǎn)生截然相反的效果。因此，這就需要借助最先進(jìn)的生物信息學(xué)技術(shù)，從而在最大程度上系統(tǒng)地描述腫瘤的免疫學(xué)特征，并提供更多的信息來增強(qiáng)我們對(duì)腫瘤免疫的理解。

NGS時(shí)代的免疫基因組學(xué)

在過去二十年中，包括全基因組測(cè)序（WGS）、全外顯子組測(cè)序（WES）和RNA測(cè)序（RNA seq）在內(nèi)的NGS已成功開發(fā)并應(yīng)用于獲取人類全基因組信息。NGS產(chǎn)生高通量基因組和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，為研究多步免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。

量化TME中的免疫細(xì)胞

TME由多種免疫細(xì)胞組成，對(duì)于腫瘤免疫細(xì)胞組分的定量，傳統(tǒng)的方法，如流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)（IHC），由于其高成本和低組織可用性，不適用于大規(guī)模分析。隨著NGS的快速發(fā)展，我們能夠通過NGS數(shù)據(jù)估計(jì)幾十種免疫細(xì)胞類型的豐度，這些數(shù)據(jù)也被證實(shí)是可靠的。這些分析的來源主要是DNA和RNA測(cè)序，尤其是后者。關(guān)于RNA序列數(shù)據(jù)，計(jì)算方法的原理主要分為基因集富集分析（GSEA）和逆卷積。

通常，基于GSEA的代表性算法包括ESTIMATE、xCell和MCP計(jì)數(shù)。基于GSEA的方法的一個(gè)共同特點(diǎn)是需要為每個(gè)感興趣的免疫細(xì)胞亞群建立特定的基因集。細(xì)胞成分的逆卷積是基于基因表達(dá)特征的體組織中細(xì)胞亞型卷積的反向過程�；�于逆卷積的工具包括decornaseq、PERT、CIBERSORT、TIMER、EPIC、quanTIseq和deconf．

腫瘤抗原的鑒定

體細(xì)胞DNA突變，包括單核苷酸變異（SNV）和插入和缺失（INDEL），是異�？乖�的主要來源。目前，基因組分析工具包（GATK）是通過分析WES、WGS和RNA序列數(shù)據(jù)來識(shí)別SNV和INDEL的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。其范圍也在擴(kuò)大，以涵蓋拷貝數(shù)變異（CNVs）和結(jié)構(gòu)變異（SVs）。

此外，異常肽需要與HLA結(jié)合，以協(xié)助T細(xì)胞受體（TCR）識(shí)別，從而引發(fā)免疫反應(yīng)。預(yù)測(cè)HLA分型對(duì)于識(shí)別腫瘤抗原至關(guān)重要。HLA miner和Seq2HLA是用于從NGS數(shù)據(jù)進(jìn)行HLA分型的兩種早期工具，PHLAT、HLAreporter、SNP2HLA、HLA－HD、optype和HLA－VBSeq在不同癌癥中的四位、六位和八位分辨率表現(xiàn)都相當(dāng)出色。在這些工具中，Polysolver是目前使用低覆蓋率WES數(shù)據(jù)的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)工具之一。

除了識(shí)別異常肽和HLA分型外，抗原MHC結(jié)合親和力是腫瘤抗原預(yù)測(cè)的下一個(gè)重點(diǎn)。許多肽－MHC－I（pMHC－I）親和力預(yù)測(cè)工具是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）訓(xùn)練方法和位置特異性評(píng)分矩陣（PSSM），如目前廣泛使用的工具NetMHC和NetMHCpan。而由于MHCII結(jié)合肽長(zhǎng)度的多樣性和結(jié)合區(qū)的“開放性”，預(yù)測(cè)pMHC II親和力更具挑戰(zhàn)性，可用的pMHC II親和力預(yù)測(cè)方法的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于pMHC－I。

單細(xì)胞時(shí)代的免疫組學(xué)

盡管利用NGS技術(shù)研究腫瘤免疫的研究極大地促進(jìn)了腫瘤學(xué)的發(fā)展，但批量測(cè)序可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)稀釋到檢測(cè)限以下，并掩蓋單個(gè)細(xì)胞的反應(yīng)。這可能會(huì)掩蓋許多重要的生物學(xué)現(xiàn)象。直到最近，單細(xì)胞相關(guān)方法的技術(shù)突破徹底改變了我們對(duì)腫瘤免疫的理解，并將研究水平從區(qū)域水平過渡到單細(xì)胞水平。

多色流式細(xì)胞術(shù)

多參數(shù)分析在功能上和物理上區(qū)分不同免疫細(xì)胞亞群的能力已促使流式細(xì)胞儀發(fā)展為常規(guī)使用的8參數(shù)流式細(xì)胞儀。此外，隨著技術(shù)的進(jìn)步，可以測(cè)量更多參數(shù)的儀器設(shè)計(jì)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，例如30參數(shù)和50參數(shù)流式細(xì)胞儀。然而，由于更可測(cè)量的參數(shù)精度較低，或更高精度可測(cè)量的參數(shù)有限，特別是由于熒光染料發(fā)射光譜之間的重疊，這些缺點(diǎn)在一定程度上限制了多色流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用和進(jìn)一步發(fā)展。

質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)

質(zhì)譜是該領(lǐng)域的一項(xiàng)最新創(chuàng)新，也稱為飛行時(shí)間（CyTOF）流式細(xì)胞儀，將流式細(xì)胞儀與質(zhì)譜儀相結(jié)合。與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀相比，質(zhì)譜儀用金屬同位素而不是熒光團(tuán)標(biāo)記抗體，然后使用飛行時(shí)間檢測(cè)器對(duì)信號(hào)進(jìn)行量化，該檢測(cè)器可檢測(cè)至少40個(gè)參數(shù)，并避免光譜重疊問題。CyTOF已被證實(shí)是一種精確的腫瘤組織高維分析方法，用于探索性免疫分析和生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)。

雖然從理論上講，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)允許我們檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞最多100個(gè)參數(shù)，但處理速度和通量受到離子飛行的限制。在霧化和電離后，細(xì)胞在預(yù)處理過程中被完全破壞，導(dǎo)致后續(xù)細(xì)胞分類應(yīng)用不可行。此外，關(guān)于測(cè)量某些低表達(dá)分子特征，CyTOF可能因其低靈敏度而不合適。

光譜流式細(xì)胞術(shù)

光譜流式細(xì)胞術(shù)是促進(jìn)傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)功效的另一項(xiàng)最新技術(shù)進(jìn)步。與質(zhì)譜儀不同，光譜流式細(xì)胞儀仍然用熒光染料標(biāo)記抗體，但用色散光學(xué)和測(cè)量全發(fā)射光譜的新型探測(cè)器取代了傳統(tǒng)光學(xué)和探測(cè)器。基于相同的原理，傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)和光譜流式細(xì)胞術(shù)保持了相當(dāng)好的兼容性，特別是在商業(yè)抗體的可用性方面，但可以更好地消除混淆因素，如光譜重疊，以提高效率。隨著補(bǔ)償技術(shù)的發(fā)展，光譜流式細(xì)胞術(shù)有可能取代多色流式細(xì)胞術(shù)。

單細(xì)胞RNA測(cè)序

基于流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)將特定標(biāo)簽與相應(yīng)的細(xì)胞亞群結(jié)合并識(shí)別該標(biāo)簽，表明必須在樣本采集之前確定目標(biāo)，而最初的目標(biāo)限定限制了從這些技術(shù)中獲得的信息，只能通過這些技術(shù)找到“已知的未知的”。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)將單細(xì)胞領(lǐng)域推向了新的高度。不再受流式細(xì)胞術(shù)等預(yù)定目標(biāo)的限制，可以使用標(biāo)準(zhǔn)NGS協(xié)議對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，以獲得可用于識(shí)別“未知”的無偏多組學(xué)分析。

目前，scRNA－seq的應(yīng)用相對(duì)其他方法更為成熟，再腫瘤免疫治療領(lǐng)域?yàn)槲覀兲峁┝撕芏喾浅Ｓ袃r(jià)值的發(fā)現(xiàn)和啟示。然而，微量物質(zhì)放大產(chǎn)生的技術(shù)噪音仍然是最重大的挑戰(zhàn)。如何分離單個(gè)細(xì)胞并保持其生物活性，如何解決放大帶來的巨大技術(shù)噪音并提高靈敏度，如何以最低的價(jià)格獲得最高數(shù)量的可測(cè)量基因，如何更有效地分析數(shù)據(jù)，這些都大大提高了單細(xì)胞測(cè)序的門檻，限制了它的廣泛應(yīng)用。

免疫組學(xué)與人工智能

人工智能在腫瘤免疫研究中的技術(shù)進(jìn)展主要涉及以下幾個(gè)方面：（1）減輕了人工識(shí)別病理切片上免疫浸潤(rùn)的工作量；（2） 提供了一種替代技術(shù)來識(shí)別肉眼難以識(shí)別的免疫細(xì)胞亞群和空間結(jié)構(gòu)；（3）提供一種非侵入性方法來預(yù)測(cè)特定患者的TME特征和對(duì)免疫治療的反應(yīng)。

基于深度學(xué)習(xí)方法的腫瘤抗原預(yù)測(cè)

破譯腫瘤抗原的第一步是預(yù)測(cè)異常肽。除了識(shí)別SNV的多種算法外，最近設(shè)計(jì)的CN學(xué)習(xí)工具也被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)CNV，表現(xiàn)出良好的性能。關(guān)于HLA分型，Bulik等人生成了一個(gè)大型綜合數(shù)據(jù)集，包括各種類型癌癥組織的HLA類型和HLA肽，并公布了可用于訓(xùn)練完整質(zhì)譜深度學(xué)習(xí)模型EDGE的數(shù)據(jù)，該模型已在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中得到驗(yàn)證。此外，最近開發(fā)了兩種很有前途的計(jì)算深度學(xué)習(xí)方法MARIA和MixMHC2pred，大大提高了MHC－II預(yù)測(cè)精度。

放射組學(xué)在腫瘤免疫中的應(yīng)用

隨著人工智能在醫(yī)學(xué)影像學(xué)中的發(fā)展，影像已經(jīng)不僅僅是一張圖片，而是一個(gè)大規(guī)模的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)，使用AI技術(shù)分析成像數(shù)據(jù)的過程就是放射組學(xué)。應(yīng)用于腫瘤免疫的放射組學(xué)技術(shù)主要用于識(shí)別反映免疫浸潤(rùn)的生物標(biāo)記物，并預(yù)測(cè)ICB治療患者的治療反應(yīng)。            

腫瘤免疫中的計(jì)算病理學(xué)

病理學(xué)中的AI，或所謂的數(shù)字病理學(xué)，通過計(jì)算分析，為探索免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用以及癌癥生物學(xué)關(guān)鍵行為之間的聯(lián)系提供了新的見解。

與放射學(xué)相似，數(shù)字病理學(xué)結(jié)合深度學(xué)習(xí)從圖像中挖掘出看不見的信息，使我們能夠在細(xì)胞或分子水平上理解TME。數(shù)字病理學(xué)可能是研究TME結(jié)構(gòu)以及癌癥生物學(xué)和治療之間關(guān)系的一種有希望的方法。

免疫組學(xué)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

識(shí)別ICB的生物標(biāo)志物用于患者分層

作為ICB的一個(gè)靶點(diǎn)，IHC檢測(cè)到的PD－L1表達(dá)水平是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物，但一些臨床試驗(yàn)表明ICB對(duì)一些PD－L1高表達(dá)患者僅具有輕微療效，而ICB也會(huì)對(duì)PD－L1低表達(dá)患者有響應(yīng)。因此，迫切需要其他生物標(biāo)記物來填補(bǔ)這一空白。

2014年，研究人員首次通過WES將腫瘤突變負(fù)荷（TMB）與接受CTLA－4抑制劑治療的患者的臨床生存率聯(lián)系起來。隨后，其他回顧性研究也證明，高TMB與持久的臨床益處相關(guān)。關(guān)于用于評(píng)估TMB的方法，由于WES的高成本和復(fù)雜性，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了兩個(gè)替代NGS平臺(tái)，即FoundationOne CDx（F1CDx）和MSKCC可操作癌癥靶點(diǎn)綜合突變譜（MSK－IMPACT），并通過多個(gè)癌癥的前瞻性研究進(jìn)行了驗(yàn)證。

另一方面，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，特別是TIL，在免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。為了發(fā)現(xiàn)更理想的治療和預(yù)后生物標(biāo)志物，單細(xì)胞測(cè)序被用于鑒定更多的免疫細(xì)胞亞群。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TCF7＋記憶樣T細(xì)胞與抗PD1治療后黑色素瘤患者的臨床改善相關(guān)，而干細(xì)胞樣TCF1＋PD1＋T細(xì)胞經(jīng)證實(shí)，在ICB治療中有助于腫瘤控制。通過單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，更多與治療和預(yù)后相關(guān)的T細(xì)胞亞群和功能狀態(tài)被確定。

ACT治療中新抗原的預(yù)測(cè)

過繼細(xì)胞療法（ACT）是通過轉(zhuǎn)基因或擴(kuò)增的自體或異體T細(xì)胞重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以增強(qiáng)抗腫瘤免疫。免疫組學(xué)主要用于在ACT治療中識(shí)別理想的腫瘤抗原。

目前，新抗原特異性TCR－T細(xì)胞尚未進(jìn)入臨床應(yīng)用，然而，令人欣慰的是，一些病例報(bào)告顯示了免疫組學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)直腸癌、乳腺癌和膽管癌患者T細(xì)胞識(shí)別腫瘤新抗原的有效性。Tran等人對(duì)轉(zhuǎn)移性膽管癌患者的樣本進(jìn)行WGS，確定了26種體細(xì)胞突變。將由突變基因組成的串聯(lián)微基因轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)染到自體APC中，然后將新抗原呈遞APC與患者來源的TIL共培養(yǎng)，最終鑒定抗原特異性CD4＋Vb22＋T細(xì)胞克隆，誘導(dǎo)上皮癌消退。

傳統(tǒng)的基于自體APC和T細(xì)胞共培養(yǎng)的新抗原選擇由于其低通量、高成本和耗時(shí)的特性而受到限制。為了消除這些障礙，開發(fā)了更多高通量免疫原性新抗原檢測(cè)技術(shù)。Li等人建立了一個(gè)基于trogocytosis的平臺(tái)，在該平臺(tái)中，當(dāng)TCR和pMHC結(jié)合時(shí)，表面標(biāo)記蛋白就從APC轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞。因此，可以通過分析標(biāo)記蛋白陽性細(xì)胞來識(shí)別理想的新抗原。未來，這些新興的免疫基因組學(xué)技術(shù)將實(shí)現(xiàn)高通量新抗原選擇。

為個(gè)體化腫瘤疫苗選擇新抗原

免疫組學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于臨床研究中的疫苗開發(fā)。一般來說，用于生成個(gè)性化疫苗的新抗原是通過分析腫瘤和正常組織的WES和RNA序列，并通過算法（如NetMHCpan）預(yù)測(cè)有效表位來識(shí)別的。

與ACT相似，腫瘤疫苗開發(fā)的關(guān)鍵參數(shù)是理想的新抗原鑒定。為了提高新抗原預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和免疫原性新表位選擇管道，免疫組學(xué)技術(shù)在這些方面做著不懈的努力。在最近的一項(xiàng)研究中，Wells等人匯編了所有新抗原預(yù)測(cè)和選擇方法，并提供了一個(gè)全新的候選測(cè)定管道，其中包括MHC呈遞和T細(xì)胞識(shí)別的14個(gè)免疫原性特征。本研究為提高腫瘤疫苗的療效和過繼性細(xì)胞治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

小結(jié)

近年來，伴隨著免疫組學(xué)領(lǐng)域新興技術(shù)的巨大飛躍，我們現(xiàn)在能夠以前所未有的深度解析腫瘤免疫。

在批量測(cè)序時(shí)代，使我們能夠更好地探索腫瘤免疫細(xì)胞的個(gè)體浸潤(rùn)模式，以及異常肽的預(yù)測(cè)、HLA分型和腫瘤抗原MHC結(jié)合親和力的預(yù)測(cè)，使用免疫組學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)腫瘤抗原已在臨床前和臨床研究中證明了其可靠的功效。

此外，隨著單細(xì)胞免疫相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，從多色流式細(xì)胞術(shù)到CyTOF，單細(xì)胞腫瘤免疫圖譜幫助我們進(jìn)行免疫細(xì)胞亞群分類，以破譯TME成分。人工智能的出現(xiàn)也為免疫組學(xué)的發(fā)展提供了新的方向。

隨著免疫組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，可持續(xù)發(fā)展需要考慮幾個(gè)問題。首先，盡管已經(jīng)實(shí)施了許多質(zhì)量控制和改進(jìn)算法原理的方法，但這些技術(shù)的有效性仍有待提高。特別是在腫瘤抗原預(yù)測(cè)、單細(xì)胞測(cè)序和空間上分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面，技術(shù)噪音和混雜因素阻礙了后續(xù)分析。其次，期待更具成本效益、更易獲取和更自動(dòng)化的技術(shù)出現(xiàn)，從而徹底改變學(xué)科的發(fā)展。第三，我們還期望研究人員充分利用現(xiàn)有技術(shù)探索腫瘤免疫，促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)型。

盡管還有很多工作要做，但免疫組學(xué)很可能在未來的腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位，其臨床價(jià)值無疑將極大地促進(jìn)該學(xué)科在免疫組學(xué)、單細(xì)胞和人工智能領(lǐng)域的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

1．Technological advances in cancer immunity： from immunogenomics to single－cell analysis and artificial intelligence． SignalTransduct Target Ther． 2021； 6： 312．

       原文標(biāo)題 : 腫瘤免疫技術(shù)的新進(jìn)展