前言

在過去十年中，我們在提高CAR-T細胞療法的療效方面取得了顯著進展。然而，其臨床益處仍然有限，尤其是在實體腫瘤中。即使在血液腫瘤中，由于多種因素，對CAR-T療法有反應的患者仍有復發(fā)的風險。這是由于T細胞特別是CAR-T細胞在癌癥中經常出現功能障礙，許多逃避機制損害了抗腫瘤免疫。

與功能失調的T細胞相比，功能性T細胞在抗原刺激下表現出一系列活性，包括（1）擴增；（2） 分泌效應細胞因子（如IL-2、IFN-γ、TNF-α、穿孔素和顆粒酶）并裂解靶細胞；（3） 去除抗原刺激后依然存活；（4）在二次抗原激發(fā)時依然有上述反應�？梢哉J為，如果以上至少一個標準不符合，T細胞就被認為是功能失調的。

目前，研究最多的T細胞功能失調狀態(tài)是耗竭，其特征是功能性T細胞的所有上述特性喪失。另一種類型的功能障礙是T細胞衰老，當T細胞在保持細胞毒性能力的同時永久性地停止其細胞周期和增殖時，就會發(fā)生衰老。

T細胞功能失調是CAR-T療法發(fā)展的一個重大障礙，這是從細胞制造步驟開始就遇到的問題。包括CAR的設計和體外操作以及培養(yǎng)條件，都可能在其中發(fā)揮關鍵作用。因此，工程化CAR-T細胞以提高其存活率并逆轉或防止耗竭表型可能會改善CAR-T細胞的治療。迄今為止，一些研究已經采取了一些限制和創(chuàng)造抗耗竭T細胞的方法，并在幾個關鍵的臨床試驗中進行了測試。這些方法可能改善CAR-T細胞的功能障礙問題，為患者帶來希望。

T細胞耗竭

T細胞耗竭與抗原的持續(xù)驅動作用息息相關。在急性感染的狀態(tài)下，幼稚的CD8+T細胞分化為短命效應細胞（SLEC）或記憶前體效應細胞（MPEC）。在抗原清除后，大多數SLEC死亡，而MPEC存活形成記憶性CD8+T細胞，形成長期保護性免疫。

而在慢性感染下，觀察到高親和力抗原特異性的CD8+T細胞分化為SLEC迅速清除，死亡，但沒有形成MPEC亞群。相反，針對低抗原親和力的CD8+T細胞擴增、耗竭，表現為增殖、細胞毒性和細胞因子產生的顯著減少，并在對抗持久性抗原的僵持中死亡。

慢性病毒感染和癌癥的一個共同特征就是，兩者都是以抗原的持久性作用為特征的長期疾病。針對腫瘤抗原的幼稚CD8+T細胞首先在外周淋巴組織啟動，產生具有自我更新特性的干細胞樣PD-1loCD8+T細胞，在趨化因子CCL5和CXCL9的作用下，向TME遷移并形成具有效應作用的PD-1loCD8+Tex。然而，TME中持續(xù)的抗原負荷最終迫使這些細胞持續(xù)分化為喪失功能的PD-1hiCD8+Tex。PD-1hi狀態(tài)伴隨著協(xié)同抑制受體表達的增強（包括Tim-3、LAG-3、CD160、2B4、TIGIT和CTLA-4）以及效應器功能的逐漸喪失。一旦CD8+Tex進入PD-1hi狀態(tài)，表觀遺傳會強制阻止去分化回到功能性干細胞樣和效應器樣PD-1lo狀態(tài)。ICB（例如，抗PD-1）促進的抗腫瘤反應僅來自淋巴或腫瘤內PD-1loCD8+Tex亞群的擴增，功能低下、ICB抵抗的PD-1hiCD8+Tex最終會凋亡。

腫瘤和慢性病毒特異性CD8+T細胞都具有與TCR信號相關基因的顯著富集（Batf、Egr2、Ezh2、Irf4、Nfatc1、Nfatc2、Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3）。這一觀察結果進一步證實了抗原的持久性參與是耗竭的主要驅動因素。

T細胞衰老

細胞衰老是一個典型的多原因過程，發(fā)生在多種細胞類型中，以細胞周期停滯為特征。T細胞衰老和T細胞耗竭是兩個截然不同的過程，衰老細胞表現出特定的衰老相關分泌表型（SASP），對其他細胞產生旁分泌影響。衰老的T細胞往往表現為CD45RA+CD27−CD28−KLRG1+CD57+表型，它們失去增殖和分泌IL-2的能力，但表達細胞溶解分子、IFN-γ和TNF-α，并在體外具有細胞毒性。

T細胞衰老通常與DNA損傷反應（DDR）的激活有關，DDR由端粒侵蝕、活性氧（ROS）引起的DNA損傷、葡萄糖或生長因子剝奪以及cAMP途徑激活觸發(fā)。衰老T細胞表現出p38活化和活性氧積累增加、線粒體活性受損、mTOR信號下調和端�？s短。盡管經歷了細胞周期阻滯，但這些細胞仍具有細胞毒性，與末端效應T細胞相似。

此外，慢性感染或自身免疫性疾病期間的反復激活也與T細胞衰老有關。腫瘤誘導的衰老T細胞已被證明可以抑制腫瘤微環(huán)境中其他T細胞的活性。越來越多的證據表明，腫瘤誘導T細胞衰老是一種逃避機制。

CAR-T細胞功能障礙的機制

經轉導的CAR-T細胞與未經修飾的T細胞表現出類似的功能障礙機制。事實上，從同一荷瘤小鼠分離的CD8+CAR-T細胞和TIL具有相似的轉錄和表觀遺傳學特征。已知有助于T細胞功能障礙的靶向通路可能改善CAR-T細胞功能。

CAR的設計

細胞外CAR結構域的類型、連接單鏈抗體與跨膜結構域的間隔區(qū)類型以及構成CAR的共刺激結構域已被證明對T細胞功能和持久性有深遠影響。臨床試驗中使用的大多數CAR來源于小鼠，這可能導致體液和CD8+T細胞介導的免疫反應，導致免疫排斥。

CAR的親和力影響強直信號，對靶細胞過強的親和力可能導致T細胞耗竭。一項研究開發(fā)了一種CAT-CAR（CD19單鏈抗體），其與CD19的親和力比從傳統(tǒng)的CAR低40倍。該結構在復發(fā)或難治性兒童BLL患者中進行了測試，臨床研究發(fā)現，14例CAR-T細胞擴增增加的患者中有11例表現出持續(xù)性。

此外，共刺激域在CAR-T細胞的持久性和有效性中也起著關鍵作用，共刺激分子包括CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40L。幾項研究發(fā)現，配備4-1BB結構域而非CD28結構域的CAR結構中的T細胞持久性增強。其他研究報告，含有4-1BB的CAR-T細胞顯示出增強的記憶T細胞（TEM）表型，這可能延遲CAR-T細胞耗竭。ICOS屬于CD28共刺激分子家族，研究證明，CAR結構中ICOS和4-1BB共刺激結構域的組合顯著增加T細胞的持久性。這些觀察結果表明，共刺激域的結構是影響CAR-T細胞持久性的重要因素。

體外操作

制造T細胞的過程需要從患者身上獲取足夠數量的健康T細胞。然而，可能在從老年患者或經化療/全身照射預處理的患者獲得衰老的T細胞。尤其是那些含有氯法拉濱或阿霉素的化療，導致淋巴細胞減少會使最終的CAR-T細胞質量不理想，用于輸注的T細胞類型嚴重影響治療的效果。

事實上，通過使CD4/CD8比率正�；�或使用幼稚或記憶細胞亞群，在臨床前模型中獲得了更好的持久性。幾項研究表明，使用早期譜系細胞富集的T細胞群能夠更好地擴增，并提高CAR-T細胞治療的持久性和療效。此外，多項研究表明，在制造過程中向細胞培養(yǎng)物中添加抗氧化劑，如N-乙酰半胱氨酸，也可抑制效應器分化并促進TSCM細胞的擴增。

免疫抑制微環(huán)境

在TME中，髓源性抑制細胞（MDSC）、癌相關成纖維細胞（CAF）和腫瘤細胞產生的免疫抑制細胞因子的存在會導致T細胞耗竭。

慢性暴露于抗原也可導致T細胞衰竭，如果抗原刺激持續(xù)存在，T細胞會發(fā)生一系列表觀遺傳、代謝和轉錄改變，出現耗竭狀態(tài)的表征。這種過程以遞進的方式發(fā)生，IL-2和TNF-α在早期丟失，IFN-γ和趨化因子分泌在耗竭進展后期減少。盡管高增殖能力也在早期喪失，但在體內受到刺激時，耗竭的T細胞仍能有限增殖。耗竭的細胞也表現出抑制性受體的高表達，如PD-1、TIM-3、LAG-3、CD160、BTLA、CTLA-4和TIGIT。

改善CAR-T細胞功能障礙的策略

表達細胞因子及其受體

第四代CAR T細胞最近被開發(fā)出來，用于抵抗TME中的免疫抑制環(huán)境，同時克服免疫耗竭。TRUMKS設計將CAR-T細胞的細胞毒性功能與具有免疫調節(jié)能力的細胞因子的原位遞送結合起來。在誘導系統(tǒng)的作用下，在CAR結合抗原后，細胞因子被合成，并以自分泌方式發(fā)揮作用，以增加T細胞的存活和擴增。細胞因子也可以旁分泌方式發(fā)揮作用，調節(jié)周圍環(huán)境，干擾TME中存在的免疫抑制細胞因子。包括IL-12、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23在內的一系列細胞因子目前正在研究中，并已進入早期臨床試驗階段。

IL-12是一種促炎癥細胞因子，可誘導Th1CD4+T細胞反應，促進CD8+克隆擴增和持續(xù)存在。它還負責調節(jié)CTL和自然殺傷（NK）細胞的細胞毒性活性，重新激活無能的腫瘤浸潤淋巴細胞，招募NK細胞，并抑制Treg。對結構性表達IL-12的CD19-CAR-T細胞的臨床前研究表明，它增強了腫瘤殺傷效果和針對癌癥抗原的免疫記憶。然而，與IL-12相關的潛在致命毒性使得有必要開發(fā)一種誘導系統(tǒng)，僅在CAR激活時限制IL-12的分泌。一些臨床研究（NCT02498912、NCT03932565和NCT03542799）正在進行和招募中。

IL-15是一種刺激CD8+T細胞和NK細胞活化、增殖和細胞毒性活性的細胞因子。IL-18增加Th1細胞細胞因子的產生，同時抑制IL-10的合成。IL-15和IL-18都是免疫反應的增強劑，已經在CAR-T細胞上進行了測試。與傳統(tǒng)的CAR-T細胞相比，分泌IL-18和IL-15的CAR-T細胞在荷瘤小鼠中顯示出增強的擴張性和持久性，并且在體外和體內顯示出增強的腫瘤細胞毒性。目前正在招募多項臨床試驗，使用工程化T細胞和NK細胞測試IL-15和IL-18分泌的CAR在實體瘤和血液瘤中的作用。

最近的研究表明，在同一個CAR-T細胞中共同表達多種細胞因子是可能的。NCT04833504是最近完成的一項臨床試驗，其中在復發(fā)或難治性B細胞淋巴瘤患者中檢測表達IL-7和CCL19的CD19+CART細胞，但結果尚未報道。目前正在招募另外兩項臨床試驗，以檢測表達IL-7的CAR-T細胞與PD-1阻斷劑或其他細胞因子的分泌相結合。

聯合檢查點阻斷療法

通過抑制檢查點信號減少耗竭的策略包括通過shRNA表達載體或CRISPR/Cas9敲除共抑制分子。許多研究報告，阻斷檢查點抑制可恢復細胞因子的產生并促進CAR-T細胞存活。此外，同時阻斷多個免疫檢查點，如PD-1、TIM-3和LAG-3，可協(xié)同增加CAR-T細胞的效應器功能。

將CAR-T細胞與免疫檢查點阻斷療法相結合可能是增強抗腫瘤活性、持久性和記憶細胞形成的有效策略。在膠質母細胞瘤和乳腺癌細胞系中，抗PD-1抗體增強了抗HER2 CAR-T細胞的抗腫瘤活性。然而，一些臨床試驗報告，在使用PD-1抑制劑和抗GD2 CAR-T細胞聯合治療神經母細胞瘤患者后，結果為陰性。

此外，一些研究已經采用其他策略來阻斷PD-1，例如基因編輯以使CAR-T細胞分泌PD-1阻斷抗體或下調PD-1。

使用干性T細胞

效應T細胞最初被認為是ACT的最佳產品，因為它們具有殺死腫瘤細胞的功效。然而，它們的持久性有限，并且擴增能力很差，很容易發(fā)生耗竭。

TSCM由于其壽命長、自我更新能力強以及在不同T細胞群中的分化能力，是ACT的理想候選。臨床研究表明，輸注表型和功能性TSCM樣CAR-T細胞（CD62L+、CD28+和CD27+）可產生良好的結果。例如，使用抗CD-19 CAR-T細胞治療的CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者顯示出與CD27+CD45RO−CD8細胞群相關的良好反應。此外，對小鼠的研究表明，注入富含CD62L+的T細胞群可增加擴增和持久性，從而導致持久的腫瘤消退。

小結

盡管在過去十年中CAR-T細胞治療取得了顯著進展，然而CAR-T細胞在患者體內可能發(fā)生的功能障礙導致有限的持久性依然是一個挑戰(zhàn)，主要原因是T細胞耗竭和衰老。通過對CAR結構設計，改變生產條件，或引入新的治療方法，我們可能創(chuàng)造抗耗竭的工程化T細胞，從而進一步擴大CAR-T細胞的臨床應用。盡管迄今為止的結果仍然有限，但可能性是無窮的，突破可能即將到來。 

參考文獻：

1.CD8+ T Cell Exhaustion in Cancer. FrontImmunol. 2021; 12: 715234.

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3. Knowns and Unknowns about CAR-T Cell Dysfunction.Cancers (Basel). 2022 Feb; 14(4): 1078.

       原文標題 : CAR-T細胞功能障礙的改善策略