前言

迄今為止，與傳統(tǒng)的抗癌治療策略相比，免疫治療被認(rèn)為是最有前景的全身性腫瘤治療方法，其中，單克隆抗體因其特異性靶向分子的能力，已成為癌癥治療中一種關(guān)鍵而有效的治療方式。然而，由于腫瘤復(fù)雜的疾病發(fā)病機(jī)制，針對(duì)單一靶點(diǎn)的單克隆抗體往往不足以表現(xiàn)出足夠的治療效果。因此，針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)的雙特異性抗體（bsAbs）應(yīng)運(yùn)而生，它的發(fā)展改變了腫瘤免疫治療的領(lǐng)域。

由于能夠同時(shí)針對(duì)腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境（TME）中的兩個(gè)表位，bsAbs逐漸成為下一代治療性抗體的一個(gè)重要和富有前景的組成部分。目前正在開(kāi)發(fā)的大多數(shù)bsAbs被設(shè)計(jì)成T細(xì)胞結(jié)合器，通過(guò)將免疫細(xì)胞，特別是細(xì)胞毒性T細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞緊密相連，從而形成一個(gè)人工免疫接觸，最終導(dǎo)致靶向腫瘤細(xì)胞的選擇性攻擊和裂解。目前，許多臨床前和臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，腫瘤免疫治療進(jìn)入了雙抗時(shí)代。

bsAb的發(fā)展史

BsAbs最初的概念是由AlfredNisonof在20世紀(jì)60年代首次提出的。他將兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合在一個(gè)分子中，并從抗牛γ球蛋白和抗卵清蛋白單價(jià)片段的混合物中獲得了一個(gè)具有雙重特異性的F（ab’）2分子。

1975年，K?hler和Milstein發(fā)明了雜交瘤技術(shù)，最終解決了生產(chǎn)單克隆抗體的問(wèn)題，開(kāi)啟了單克隆抗體治療的新時(shí)代。1983年，Milstein和Cuello開(kāi)創(chuàng)了quadroma技術(shù)，該技術(shù)基于分泌Abs混合物的兩種不同雜交瘤細(xì)胞系的體細(xì)胞融合，包括具有雙重特異性的鼠IgG形式的bsAb。然而，bsAb的低產(chǎn)率以及難以從密切相關(guān)的錯(cuò)配副產(chǎn)物中純化所需的Ab是一個(gè)重大問(wèn)題。

1988年，James Huston和他的同事發(fā)明了單鏈抗體片段（scFv），它最大限度地減少了復(fù)性問(wèn)題，例如不正確的結(jié)構(gòu)域配對(duì)或聚集。1996年，Genentech的科學(xué)家們利用重組DNA技術(shù)發(fā)明了knob－into－h(huán)ole技術(shù)，克服了Quadrome技術(shù)的局限性。通過(guò)在人類(lèi)IgG的CH3結(jié)構(gòu)域之間的界面突變選定的氨基酸，可以減少I(mǎi)gG重鏈的錯(cuò)配。這種技術(shù)利用更有利的蛋白質(zhì)相互作用，最終可以形成高達(dá)90％的正確雙特異性重鏈配對(duì)。隨后，隨著抗體工程和生物學(xué)的進(jìn)展，bsAb的不同概念和結(jié)構(gòu)正在不斷演變。

目前，許多bsAb已被開(kāi)發(fā)為治療實(shí)體癌和血液癌的藥物。截至2021年12月，3種類(lèi)型的bsAb已被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于診所治療癌癥。

bsAb的模式

抗體由四條多肽鏈組成，分子量較大的兩條鏈稱為重鏈（H鏈），而分子量較小的兩條鏈稱為輕鏈（L鏈）。在單抗中，兩條H鏈和兩條L鏈的氨基酸組成完全相同，而雙特異性抗體的開(kāi)發(fā)是通過(guò)共表達(dá)兩條不同的H鏈和兩條不同的L鏈。從10種可能的H2L2重組混合物中獲得功能性雙特異性抗體是雙特異性抗體開(kāi)發(fā)的最初挑戰(zhàn)之一，這通常稱為鏈相關(guān)問(wèn)題。

在過(guò)去幾十年里，研究者們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多策略，以解決這一問(wèn)題。由這些策略誘導(dǎo)的不同設(shè)計(jì)特征或功能特性可用于所產(chǎn)生的雙特異性抗體模式的分類(lèi)。            

基于片段的模式（Fragment－based formats）

基于片段的雙特異性抗體簡(jiǎn)單地將多個(gè)抗體片段結(jié)合在一個(gè)分子中，不含F(xiàn)c區(qū)域（fragment crystallizable，可結(jié)晶片段，與抗原結(jié)合片段Fab相對(duì)），避免了鏈相關(guān)問(wèn)題，優(yōu)勢(shì)是產(chǎn)量高、成本低；缺點(diǎn)是半衰期相對(duì)較短。此外，基于片段的雙特異性抗體可能會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定性和聚合問(wèn)題。

對(duì)稱模式（Symmetric formats）

對(duì)稱模式的雙特異性抗體保留了Fc區(qū)域，更接近于天然抗體，但在大小和結(jié)構(gòu)上有所不同。這些差異可能對(duì)與天然抗體相關(guān)的有利特性（如穩(wěn)定性和溶解度）產(chǎn)生負(fù)面影響，從而可能損害這些雙特異性抗體的理化和／或藥代動(dòng)力學(xué)特性。

不對(duì)稱模式（Asymmetric formats）

大多數(shù)不對(duì)稱模式的雙特異性抗體與天然抗體非常相似，被認(rèn)為具有最低免疫原性的潛力。不過(guò)，解決鏈相關(guān)問(wèn)題可能涉及到的復(fù)雜工程可能會(huì)抵消一些不對(duì)稱模式雙特異性抗體的這一優(yōu)勢(shì)。

bsAb的作用機(jī)制

根據(jù)其功能機(jī)制，BsAb可分為4類(lèi)：結(jié)合同一抗原的兩個(gè)表位、細(xì)胞－細(xì)胞接合器、雙功能調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞治療中的BsAb。其中，T細(xì)胞接合器是臨床研究中應(yīng)用最廣泛的形式，已被證明能誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫細(xì)胞激活。

結(jié)合同一抗原的兩個(gè)表位

人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了同時(shí)針對(duì)同一靶抗原內(nèi)2個(gè)不同表位的雙副表位抗體。例如，靶向癌胚抗原（CEA）或VEGF2的bsAb被開(kāi)發(fā)用于治療癌癥。人們還開(kāi)發(fā)了幾種bsAb來(lái)中和病毒抗原，例如，針對(duì)HBV表面抗原和HIV－1包膜蛋白的bsAb顯示出針對(duì)同源抗原的中和活性。

細(xì)胞接合器

細(xì)胞接合器連接兩種不同類(lèi)型的細(xì)胞，主要是腫瘤細(xì)胞和T／NK細(xì)胞，以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞溶解。細(xì)胞接合器由TAA靶向部分和效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別部分組成，并進(jìn)一步分為T(mén)細(xì)胞接受器和NK細(xì)胞接受器。

T細(xì)胞接合器利用TAA和TCR成分（主要是CD3），它們連接腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞，繞過(guò)TCR－MHC－I相互作用。因此，無(wú)論抗原特異性如何，T細(xì)胞結(jié)合器都會(huì)觸發(fā)T細(xì)胞活化，產(chǎn)生包括穿孔素和顆粒酶在內(nèi)的細(xì)胞毒性分子，以殺傷腫瘤細(xì)胞。

BiTE是T細(xì)胞結(jié)合器的一種形式，通過(guò)靶向TAA和CD3的單鏈抗體將腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞結(jié)合，用于T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷。靶向CD19和CD3的blinatumomab是臨床上典型的BiTE，2014年，blinatumomab成為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的BsAb，用于治療ALL患者，在隨后的幾年里，blinatumomab的治療范圍進(jìn)一步拓寬，2018年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)其用于首次或第二次完全緩解后MRD≥0．1％的pre－B ALL患者群體的治療。目前，超過(guò)60例BiTE形式的雙抗正在進(jìn)行I／II期臨床試驗(yàn)。

NK細(xì)胞接合器將CD16A＋NK細(xì)胞重定向至腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化。與BiTE相比，NK細(xì)胞接受者表現(xiàn)出較少的不良反應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性。多種細(xì)胞毒性受體可激活NK細(xì)胞：CD16（FcγRIII）、天然細(xì)胞毒性受體（NCR；NKp30、NKp44、NKp46）、C型凝集素樣受體NKG2D（CD314）和CD94／NKG2C。最近，抗CD30×CD16A的NK細(xì)胞接合器（AFM13）在AACR 2022的報(bào)告中展示了不俗的抗腫瘤效果。

雙功能調(diào)制劑

雙功能調(diào)節(jié)劑同時(shí)結(jié)合兩種不同的免疫共刺激或共抑制分子，誘導(dǎo)靶細(xì)胞的功能改變。大多數(shù)雙功能調(diào)節(jié)劑靶向PD－1／PD－L1軸和其他免疫抑制分子，如CTLA－4（CD152）、TIM－3、LAG－3或TIGIT。MEDI5752（PD－1×CTLA－4）抑制PD－1＋激活的T細(xì)胞中CTLA－4的功能，誘導(dǎo)PD－1的快速內(nèi)化和降解。與PD－1和CTLA－4單抗聯(lián)合治療相比，MEDI5752的活性顯著增強(qiáng)。針對(duì)其他檢查點(diǎn)分子的雙功能性抑制劑，包括LAG－3和TIGIT，也正在開(kāi)發(fā)中。

過(guò)繼細(xì)胞治療中的bsAbs

盡管CAR－T細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中顯示出療效，但也觀察到了副作用，包括CRS、神經(jīng)毒性和靶向非腫瘤效應(yīng)。為了將不良反應(yīng)降至最低，正在進(jìn)行用BsAbs體外激發(fā)T細(xì)胞的研究。與單獨(dú)的BsAb和T細(xì)胞輸注相比，在體外BsAb武裝的T細(xì)胞治療可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤反應(yīng)，有效滲透到腫瘤部位，并減少細(xì)胞因子的釋放，從而將系統(tǒng)不良反應(yīng)降至最低。

OKT3×hu3F8 BsAb武裝T細(xì)胞（GD2BATs）在體外誘導(dǎo)特異性殺傷GD2陽(yáng)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤和骨肉瘤細(xì)胞系。在GD2陽(yáng)性腫瘤患者的I期試驗(yàn)中，GD2BATs在一些患者中顯示出臨床反應(yīng)，且無(wú)明顯副作用。

BiTE與CAR－T

BiTE和CAR－T細(xì)胞療法之間有明顯的相似性。和BiTEs一樣，CAR－T細(xì)胞能夠通過(guò)可變的TAA靶向抗原結(jié)合域（通常是單鏈抗體）識(shí)別腫瘤細(xì)胞。然而，與BiTEs激活不同的是，T細(xì)胞不是通過(guò)內(nèi)源性TCR復(fù)合物激活的，而是通過(guò)來(lái)自CD3和共刺激分子（如4－1BB和CD28）的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域激活的，這些區(qū)域被整合到一個(gè)合成的細(xì)胞表面受體中，細(xì)胞外部分含有單鏈抗體（即CAR）。因此，用CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)患者的T細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致這些效應(yīng)細(xì)胞針對(duì)選定的靶TAA重新定向，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。與BiTE的生產(chǎn)不同，CAR－T細(xì)胞制造需要體外基因修飾和細(xì)胞擴(kuò)增，特別是自體T細(xì)胞，這是一個(gè)相對(duì)低效、資源密集、耗時(shí)且成本高昂的過(guò)程。

T細(xì)胞與靶細(xì)胞之間免疫突觸的形成，細(xì)胞的連續(xù)殺傷能力，以及細(xì)胞溶解蛋白如穿孔素和顆粒酶的定向釋放，是CAR－T細(xì)胞和BiTEs共同的作用模式特征。此外，BiTEs和CAR－T細(xì)胞都是通過(guò)CD8＋T細(xì)胞和CD4＋T細(xì)胞發(fā)揮其效應(yīng)功能。然而，體外和體內(nèi)研究表明，來(lái)自低分化和未接觸抗原的T細(xì)胞亞群，如干細(xì)胞記憶T細(xì)胞（Tscm）或中心記憶T細(xì)胞（Tcm）的CAR－T細(xì)胞具有優(yōu)越的抗腫瘤活性、增強(qiáng)的擴(kuò)增能力和持久的存活期，而B(niǎo)iTE介導(dǎo)靶細(xì)胞死亡主要通過(guò)抗原經(jīng)歷的T細(xì)胞在激活后分化為效應(yīng)記憶T（Tem）細(xì)胞。

下一代的T細(xì)胞結(jié)合器

CiTE

雙功能檢查點(diǎn)抑制性T細(xì)胞接合器（CiTEs）將局部限制性免疫檢查點(diǎn)抑制功能與BiTEs的T細(xì)胞重定向功能結(jié)合在一個(gè)分子中。CiTEs將PD－1／PD－L1的抑制性功能局限在靶向TAA相互作用的重定向T細(xì)胞局部，因此，該分子BiTE部分的功效得到增強(qiáng)，同時(shí)避免了與抗PD－1或抗PD－L1 ICI相關(guān)的T細(xì)胞的全身活化，從而限制了與免疫有關(guān)的不良事件的風(fēng)險(xiǎn)。

這種新型T細(xì)胞接合器的概念證明已在AML的臨床前模型中得到驗(yàn)證�；�于類(lèi)似的機(jī)制，Horn等人已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種抗PD－L1–CD3的BiTE，它同時(shí)將內(nèi)源性T細(xì)胞和NKT細(xì)胞重新定位到PD－L1＋細(xì)胞。臨床前研究表明，當(dāng)與其他不能中和PD－1／PD－L1介導(dǎo)的免疫抑制的免疫療法聯(lián)合使用時(shí)，這種形式的CiTE可能對(duì)PD－L1表達(dá)的實(shí)體瘤患者有效。

SMITE

同時(shí)多重相互作用BiTE（SMITEs）是另一種創(chuàng)新的T細(xì)胞參與治療形式。SMITEs由兩個(gè)單獨(dú)的BiTE組成，每一個(gè)都針對(duì)不同的抗原，其中一個(gè)以CD3為靶點(diǎn)，在與靶TAA結(jié)合時(shí)誘導(dǎo)TCR信號(hào)，而另一個(gè)靶向CD28以提供T細(xì)胞共刺激信號(hào)。例如，含有抗PD－L1–CD28 BiTE的SMITEs可通過(guò)CD28與T細(xì)胞的結(jié)合將抑制性PD－L1信號(hào)轉(zhuǎn)化為正向的共刺激信號(hào)，這些T細(xì)胞通過(guò)第二個(gè)TAA特異性和CD3靶向的BiTE進(jìn)一步潛在地共同激活。SMITEs可以在任何一種BiTE的最低活性濃度甚至更低的濃度下，依然發(fā)揮有效作用。SMITE平臺(tái)不僅提供了克服由免疫檢查點(diǎn)蛋白介導(dǎo)的抵抗機(jī)制的機(jī)會(huì)，而且還可以靶向更廣泛的細(xì)胞表面TAA，以提高腫瘤的特異性，同時(shí)限制免疫逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。

TriKE

增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒性的另外一種形式是三特異性殺傷接合器（TriKEs），其主要目的是利用NK細(xì)胞對(duì)抗癌細(xì)胞的活性，并包含與免疫刺激細(xì)胞因子相連的雙特異性抗體。一種抗CD33－CD16／IL－15的TriKE能將NK細(xì)胞定向到髓系母細(xì)胞，目前正在AML患者中進(jìn)行臨床研究（NCT03214666）。

DART

改變“典型”BiTE的結(jié)構(gòu)可以提供多種新的治療方法。例如，新的雙親和力再靶向蛋白（DART）已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，它們具有比BiTEs更有利的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，包括更大的穩(wěn)定性和將T細(xì)胞毒性靶向惡性細(xì)胞的最佳重定向。DART分子是由提供雙重抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)Fv鏈組成的雙特異性diabody，通過(guò)二硫鍵和非共價(jià)鍵組裝，從而提高穩(wěn)定性并限制鏈內(nèi)域相互作用

DARTs的結(jié)構(gòu)使目標(biāo)和效應(yīng)細(xì)胞之間的最佳交互作用成為可能，從而產(chǎn)生高水平的靶細(xì)胞殺傷。在臨床前模型相比，DARTs比BiTEs表現(xiàn)出更好的細(xì)胞毒性。在臨床前模型中，DART分子已成功應(yīng)用于NK細(xì)胞或T細(xì)胞對(duì)惡性B細(xì)胞的再靶向（抗CD16–CD32B DART或抗CD19–CD3 DART duvortuxizumab，也稱為MGD011）和T細(xì)胞向CD123＋AML細(xì)胞的再靶向（flotetuzumab；MGD006）或糖蛋白A33表達(dá)的胃腸道癌細(xì)胞（gpA33；MGD007）；這些藥物大多已進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段（NCT02454270、NCT02152956、NCT03739606、NCT02248805和NCT03531632）。

重要的是，DART分子可被設(shè)計(jì)成包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域（例如，duvortuxizumab、gpA33和PRS－343），其半衰期更長(zhǎng)，因此有助于使用更方便的間歇給藥，而不是連續(xù)輸注。

CrossMAb

傳統(tǒng)的BiTEs是對(duì)稱設(shè)計(jì)的，CD3和TAA為1：1，通過(guò)1：2設(shè)計(jì)增加結(jié)合能力可能提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，同時(shí)避免在TAA缺失的情況下CD3在T細(xì)胞上的激活。一種被稱為CrossMAb技術(shù)的創(chuàng)新設(shè)計(jì)平臺(tái)能夠以完整的IgG形式生成1：2價(jià)的雙特異性抗體。Cibisatamab（又稱CEA－TCB）是一種CrossMAb 形式的雙抗，CD3和CEA的效價(jià)為1：2。Cibisatamab于2014年進(jìn)入I期試驗(yàn)，目前正在表達(dá)CEA的實(shí)體瘤患者中進(jìn)行研究（NCT02324257和NCT02650713）。

第一階段的結(jié)果顯示了很好的療效并誘導(dǎo)出高度炎癥性的TME。同時(shí)，至少有8種基于IgG的雙特異性抗體已經(jīng)使用CrossMAb技術(shù)進(jìn)行開(kāi)發(fā)，目前正在進(jìn)行臨床研究或處于臨床前開(kāi)發(fā)后期。其中抗CD20–CD3的REGN1979對(duì)NHL患者有良好的療效。

ImmTACs

抗癌免疫動(dòng)員單克隆T細(xì)胞受體（ImmTACs）是一種新型的雙功能抗體藥物，結(jié)合了基于TCR的靶向系統(tǒng)和抗CD3單鏈抗體效應(yīng)器功能。因此，這些分子可以將多克隆效應(yīng)性T細(xì)胞重定向到肽－MHC復(fù)合物中呈現(xiàn)的TAAs或腫瘤特異性新抗原，包括來(lái)自細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗原。通過(guò)利用可溶性高親和力單克隆TCR結(jié)構(gòu)域促進(jìn)大量多克隆效應(yīng)T細(xì)胞的招募，這類(lèi)分子有潛力以現(xiàn)成的形式克服非炎性環(huán)境的TME。

Tebentafusp是第一個(gè)ImmTAC，靶向黑色素瘤相關(guān)抗原gp100與HLA－a＊02：01復(fù)合物呈遞的多肽；這種藥物已經(jīng)在晚期葡萄膜黑色素瘤患者中顯示出臨床活性，并于2016年被FDA授予孤兒藥資格，并于2019年獲得快速通道資格。

小結(jié)

在過(guò)去的30年里，人們目睹了一個(gè)巨大的轉(zhuǎn)變，從僅僅開(kāi)發(fā)和改造基本的Abs，發(fā)展到更復(fù)雜的Ab衍生物，其形狀和尺寸多種多樣，尤其是bsAb。bsAb技術(shù)在臨床應(yīng)用中具有非凡的前景，吸引了研究人員的注意并已發(fā)展出極為豐富的形式，為基于BSAB的癌癥免疫治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

目前臨床試驗(yàn)中的大多數(shù)bsAb（67％）旨在對(duì)抗血液惡性腫瘤。相比之下，靶向?qū)嶓w腫瘤的bsAb值得進(jìn)一步研究，因?yàn)槠鋵?duì)正常組織或其他復(fù)雜因素（包括免疫耐受性癌間質(zhì)、新生血管紊亂，bsAb藥物的滲透不足）有不可避免的不良影響。因此，人們對(duì)正在進(jìn)行的實(shí)體腫瘤中的bsAb研究充滿熱情，這些研究有望在不久的將來(lái)產(chǎn)生有希望的結(jié)果�？傊�，bsAb研究的結(jié)果證明了這些分子在新的藥物設(shè)計(jì)和隨后的癌癥治療臨床應(yīng)用中具有良好的前景。

參考文獻(xiàn)：

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2． T cell－engaging therapies － BiTEs and beyond． Nat Rev Clin Oncol． 2020 Jul；17（7）：418－434．

       原文標(biāo)題 : 腫瘤免疫治療中的雙特異性抗體