前言

RNA剪接失調(diào)是幾乎所有腫瘤類型的分子特征。癌癥相關(guān)的剪接改變既來自反復(fù)突變，也來自調(diào)控剪接催化的反式作用因子的表達(dá)改變。癌癥相關(guān)剪接失調(diào)可通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加、凋亡減少、遷移和轉(zhuǎn)移潛能增強、對化療的抵抗和逃避免疫監(jiān)測。

近年來，對影響癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的RNA剪接亞型的深入研究，使我們可以針對這些個體事件開發(fā)治療的新方法。調(diào)節(jié)或抑制RNA剪接的小分子藥物已進(jìn)入臨床開發(fā)，成為非常有前景的抗癌藥物。

剪接催化與調(diào)控

RNA剪接是一個高度調(diào)控的過程，由剪接體以及其他調(diào)控剪接因子來完成。剪接體識別前mRNA中的核心調(diào)控序列，包括標(biāo)記內(nèi)含子－外顯子邊界的5′和3′剪接位點（5′SS和3′SS）、分支點位點（BPS）和多嘧啶區(qū)。

有兩種剪接體復(fù)合物進(jìn)行剪接反應(yīng)，U2型（主要剪接體）或U12型（次要剪接體）。它們主要區(qū)別在各自剪接反應(yīng)中使用的RNA組分以及它們識別的剪接位點序列。U2型剪接體優(yōu)先識別GT－AG剪接位點，負(fù)責(zé)去除約99％的內(nèi)含子；而識別AT－AC和GT－AG位點的U12型剪接體參與去除少于1％的內(nèi)含子，并調(diào)節(jié)一組獨特的剪接事件。

除了與5′SS和3′SS相鄰的核苷酸外，剪接體識別的核心調(diào)控序列有很大的多樣性。這就需要一個額外的調(diào)控，這種調(diào)控依賴于順式作用調(diào)控序列和反式作用剪接因子蛋白，可以加強或削弱剪接體對剪接位點的識別。這些順式作用序列和反式作用剪接因子一起調(diào)節(jié)選擇性剪接，允許單個基因編碼多個不同的RNA亞型，這些RNA亞型可以被翻譯功能不同的蛋白質(zhì)亞型。目前估計，每個人類蛋白質(zhì)編碼基因平均編碼7．4個RNA亞型。

調(diào)節(jié)選擇性剪接的反式剪接因子是一類RNA結(jié)合蛋白（RBPs），它們識別并結(jié)合前mRNA上的順式調(diào)節(jié)元件，即外顯子或內(nèi)含子剪接增強子（ESE或ISE）或外顯子和內(nèi)含子剪接沉默子（ESS或ISS）序列，并分別促進(jìn)或抑制該外顯子納入成熟mRNA。

腫瘤發(fā)生中的剪接改變

影響剪接機(jī)制或剪接因子成分的突變或表達(dá)變化可在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過誘導(dǎo)影響許多下游基因的剪接改變，這些改變有可能破壞基因產(chǎn)物和癌癥途徑的網(wǎng)絡(luò)。

剪接因子的復(fù)發(fā)突變

SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2中的復(fù)發(fā)性體細(xì)胞突變經(jīng)常發(fā)生在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，包括骨髓增生異常綜合征（MDS）、慢性粒細(xì)胞單核細(xì)胞白血�。–MML）、急性髓細(xì)胞白血�。ˋML）和慢性淋巴細(xì)胞白血�。–LL）。這些突變通常被稱為“剪接體突變”。

SF3B1是癌癥中最常見的突變剪接體成分，約30％的MDS患者中檢測到復(fù)發(fā)性體細(xì)胞突變。SF3B1突變也在其他癌癥中檢測到，包括15％的CLL、3％的胰腺癌、1．8％的乳腺腺癌、1％的皮膚黑色素瘤和20％的葡萄膜黑色素瘤（UVM）。SF3B1是U2 snRNP的核心成分，參與BPS識別和剪接復(fù)合體a組裝。SF3B1突變幾乎普遍作為雜合錯義突變發(fā)生，影響羧基末端HEAT結(jié)構(gòu)域（HDs）內(nèi)的多個熱點殘基。這些突變導(dǎo)致BPS識別改變，進(jìn)而導(dǎo)致3′SS識別改變，從而導(dǎo)致廣泛的剪接改變。

編碼其他剪接體成分的基因也在血液學(xué)和實體惡性腫瘤中檢測到突變。例如，RBM10在肺癌、甲狀腺癌和其他癌癥中反復(fù)突變，導(dǎo)致剪接斷裂和促腫瘤效應(yīng)。SF3A1、PRPF8、SF1、HNRNPK、U2AF2、SRSF6、SRSF1、SRSF7、TRA2B和SRRM2突變也有報道，盡管發(fā)生率相對較低。最近的一項研究表明，超過100個編碼剪接體成分的基因包含多種癌癥類型的驅(qū)動突變。

剪接因子表達(dá)改變

剪接因子水平和活性在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后受到嚴(yán)格控制。調(diào)控途徑的任何改變都可能導(dǎo)致剪接因子表達(dá)的改變，從而導(dǎo)致剪接因子下游靶標(biāo)的選擇性剪接的改變。復(fù)發(fā)性剪接因子突變在血液學(xué)惡性腫瘤中很常見，而剪接因子水平的改變和拷貝數(shù)的變化在實體瘤中尤為突出。

剪接因子失調(diào)與多種癌癥類型之間的因果關(guān)系已被確定。值得注意的是，在乳腺腫瘤中上調(diào)的幾種剪接因子具有致癌功能，足以促進(jìn)乳腺癌模型中的腫瘤發(fā)生。剪接因子也可作為腫瘤抑制劑，因此某些剪接因子下調(diào)可有助于腫瘤的發(fā)展。

改變剪接因子表達(dá)促腫瘤的一個典型例子是乳腺、肺、結(jié)腸和膀胱腫瘤中SR蛋白SRSF1的上調(diào)。SRSF1過表達(dá)增強了與減少細(xì)胞死亡、增加細(xì)胞增殖和抵抗DNA損傷相關(guān)同種型的選擇性剪接，導(dǎo)致體內(nèi)和體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化。SRSF1可與MYC協(xié)同作用，通常導(dǎo)致乳腺癌和肺癌患者的腫瘤分級更高，生存期更短。

在癌癥中經(jīng)常上調(diào)的其他剪接因子包括SR蛋白家族的其他成員，例如SRSF4、SRSF6或SR樣TRA2β；hnRNP蛋白家族的成員，例如hnRNPA1、hnRNPA2／B1、hnRNPM或PTB；以及其他剪接因子，例如ESPR1、ESPR2、RBM5、RBM6和RBM10。相反，幾種剪接因子在人類腫瘤中被下調(diào)，包括hnRNPK、ESRP1、ESRP2、RBFOX2、RBM5或QKI。

RNA同種型的異常剪接

腫瘤通常表現(xiàn)出比正常組織更復(fù)雜的剪接序列，致瘤性可能與轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)的癌癥特異性替代剪接事件有關(guān)。癌癥相關(guān)的替代剪接亞型可以提供增殖優(yōu)勢，改善細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞免于死亡，重新連接細(xì)胞代謝或細(xì)胞信號，促進(jìn)有利的微環(huán)境，改變免疫反應(yīng)或?qū)崿F(xiàn)耐藥性。

腫瘤中的差異剪接可導(dǎo)致增加增殖潛能的同種型表達(dá)。例如，編碼蛋白S6K1的RPS6KB1基因的剪接與持續(xù)的細(xì)胞增殖和腫瘤生長有關(guān)。RPS6KB1－1亞型產(chǎn)生全長蛋白，而通過差異剪接可以產(chǎn)生一個較短的RPS6KB1－2亞型，該亞型缺少一部分激酶結(jié)構(gòu)域并差異激活下游mTORC1信號。RPS6KB1－2在乳腺癌、肺癌細(xì)胞和原發(fā)性腫瘤中高表達(dá)，其敲除降低了癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長。

為了生存，癌細(xì)胞需要獲得抵抗細(xì)胞死亡的能力。控制細(xì)胞死亡的多個基因在剪接水平上受到調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生不同的亞型，其表現(xiàn)出抗凋亡或促凋亡功能，包括BCL－2家族成員，如BCL2L1、BIM或MCL1。BCL2L1剪接可以產(chǎn)生兩種亞型，BCLxL和BCLxS，分別抑制和促進(jìn)凋亡。

腫瘤抑制因子逃避的一個例子涉及轉(zhuǎn)錄因子KLF6，其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和存活，并且通常通過突變或缺失在腫瘤中失活。KLF6的選擇性剪接可以產(chǎn)生致癌亞型KLF6－SV1，而不是全長腫瘤抑制亞型。在前列腺、肺、卵巢、腦、乳腺、胰腺和肝臟腫瘤中檢測到KLF6－SV1水平升高，并與生存率低相關(guān)。

腫瘤進(jìn)展中的剪接改變

許多替代剪接亞型與增加的細(xì)胞侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散有關(guān)。一些編碼調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和遷移的蛋白基因在細(xì)胞入侵或EMT期間表達(dá)不同的剪接同種型。這些包括CD44、RAC1、RON或MENA的選擇性剪接，這些剪接可產(chǎn)生使細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的同種型。

例如，MENA是調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和運動的肌動蛋白成核和聚合調(diào)節(jié)因子，它產(chǎn)生三種在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮不同作用的主要亞型。包含外顯子INV或11a的MENA－INV或MENA11a亞型，以及跳過外顯子6產(chǎn)生的MENA?v6亞型。這些剪接事件由許多剪接因子調(diào)節(jié)，包括ESPR1和ESPR2。在腫瘤進(jìn)展過程中，它們之間的比例發(fā)生變化，MENA－INV和MENA?v6升高，MENA11a降低，并與腫瘤分級和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

剪接改變還可以影響血管生成，促進(jìn)腫瘤生長和向遠(yuǎn)處器官擴(kuò)散。VEGFA的選擇性剪接導(dǎo)致在血管生成中具有不同功能的蛋白質(zhì)同種型。包含促血管生成的VEGFAxxx亞型和抗血管生成的VEGFAxxxb亞型。兩種同種型在體外對其受體表現(xiàn)出相似的親和力；然而，VEGFAxxxb不能刺激VEGF信號傳導(dǎo)，從而抑制血管生成。

此外，選擇性剪接還影響免疫細(xì)胞發(fā)育和功能的多個調(diào)節(jié)步驟。例如，CD45的選擇性剪接是T細(xì)胞活化過程中的關(guān)鍵步驟，而CD44選擇性剪接參與淋巴細(xì)胞活化。類似地，白細(xì)胞介素受體的可溶性同種型，如IL－4R、IL－5R和IL－6R，通過免疫細(xì)胞中的選擇性剪接產(chǎn)生。

剪接改變與耐藥性

選擇性剪接的改變可通過對靶標(biāo)或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響導(dǎo)致對靶向治療的抵抗。例如，使用vemurafenib（一種BRAF－V600E抑制劑）治療可選擇表達(dá)替代剪接BRAF亞型的耐藥細(xì)胞，該亞型不編碼通常調(diào)節(jié)BRAF二聚和激活的RAS結(jié)合域。類似地，BRCA1Δ11q亞型，一種缺少外顯子11的變體，促進(jìn)對聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制和順鉑的抵抗。此外，HER2的選擇性剪接，例如跳過外顯子16，降低了對HER2靶向抗體trastuzumab的敏感性。

治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的一個突破是開發(fā)針對CD19的CAR－T細(xì)胞療法。然而，50％的患者由于免疫排斥和T細(xì)胞耗竭或靶向表位丟失而復(fù)發(fā)。表位缺失可由CD19的選擇性剪接驅(qū)動，產(chǎn)生缺少外顯子2且不被CAR－T細(xì)胞識別的剪接同種型，導(dǎo)致耐藥性。另一個例子是CD22的選擇性剪接，外顯子5和6的跳過導(dǎo)致對靶向CD22的CAR－T細(xì)胞的抵抗。

靶向剪接的癌癥治療

鑒于剪接在腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，人們對靶向替代剪接用于癌癥治療有著濃厚的興趣。各種方法，從抑制關(guān)鍵剪接體蛋白或調(diào)控剪接因子到調(diào)節(jié)特定的選擇性剪接事件，都在臨床前和臨床開發(fā)中。

靶向中心剪接體

癌癥治療中靶向剪接的一種方法是抑制剪接體本身。SF3B1是對BPS和3′SS選擇至關(guān)重要的剪接體組件，限制其功能會在剪接體組裝的早期階段破壞剪接。已經(jīng)鑒定或開發(fā)了多種靶向SF3B1的天然和衍生物分子，包括FR901464及其衍生物；sudemycin E；聚二烯內(nèi)酯B和FD－895及其衍生物（例如E7107和H3B－8800）。

另一種廣譜剪接體抑制劑是異銀杏素，它阻止U4／U5／U6三snRNP的募集，并導(dǎo)致剪接體前A復(fù)合物的停滯。在臨床前模型中，異銀杏素治療影響多種癌癥相關(guān)途徑，包括細(xì)胞死亡、侵襲和免疫應(yīng)答。

靶向替代剪接因子

靶向特異性RBPs和剪接因子的抑制劑開發(fā)一直具有挑戰(zhàn)性，部分原因是缺乏大多數(shù)經(jīng)典小分子抑制劑方法容易靶向的催化活性位點。最近，通過偶然發(fā)現(xiàn)，幾種芳基磺胺類藥物作為分子膠，通過募集CUL4－DCAF15泛素連接酶復(fù)合物導(dǎo)致RBP RBM39降解，RBM39的敲除廣泛影響替代剪接事件。目前，芳基磺胺類藥物的臨床試驗正在進(jìn)行中。

靶向上游調(diào)節(jié)蛋白

剪接因子受到廣泛的翻譯后修飾，為治療干預(yù)提供了機(jī)會。例如，剪接體蛋白和剪接因子受到廣泛的精氨酸甲基化的影響，因此I型（PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8）和II型（PRMT5）蛋白精氨酸甲酯轉(zhuǎn)移酶通過Sm蛋白和調(diào)控剪接因子的甲基化對組成性剪接和選擇性剪接的調(diào)控至關(guān)重要。已經(jīng)鑒定出許多抑制I型或II型PRMT的小分子，它們都顯示出有前景的臨床前活性，其中一些目前處于早期臨床試驗中。

靶向RNA剪接同種型

由于許多與疾病相關(guān)的剪接因子目前不能用小分子藥物治療，因此靶向關(guān)鍵的下游錯誤剪接RNA可能會提供一種有前途的治療方法。然而，迄今為止，只有少數(shù)通過靶向特定RNA轉(zhuǎn)錄物的化合物顯示出臨床效用。

Risdiplam是美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的第一個用于治療脊髓性肌萎縮癥的小分子，其作用是靶向RNA轉(zhuǎn)錄。Risdiplam通過選擇性結(jié)合SMN2前mRNA中外顯子7中的剪接增強子和5′SS下游的內(nèi)含子來促進(jìn)外顯子7的剪接。

寡核苷酸的剪接調(diào)節(jié)

剪接切換ASO是一種短的、化學(xué)修飾的RNA寡聚體，旨在結(jié)合靶標(biāo)前mRNA中的反向互補序列，從而防止其與剪接機(jī)制的相互作用。剪接切換ASO可以設(shè)計成專門針對5′SS或3′SS，從而阻止其使用；針對剪接增強子序列，從而防止剪接因子激活劑的結(jié)合并促進(jìn)外顯子跳躍；靶向剪接沉默序列，從而防止剪接因子阻遏物的結(jié)合并促進(jìn)外顯子的剪接；靶向由于突變而產(chǎn)生的隱性剪接位點，從而恢復(fù)野生型剪接位點。

ASO糾正癌癥相關(guān)的選擇性剪接事件已產(chǎn)生細(xì)胞系和動物模型中有前景的抗癌表型。例如，BRD9基因編碼一個毒性外顯子，當(dāng)發(fā)生在SF3B1突變腫瘤中時，該外顯子導(dǎo)致其mRNA降解。強制跳過該外顯子的ASO可使UVM小鼠模型中BRD9蛋白水平增加，腫瘤體積減少。

靶向替代RNA剪接的新策略

一些旨在靶向剪接因子或特定替代剪接事件的新方法已經(jīng)出現(xiàn)。一個例子是誘餌寡核苷酸，其通過競爭其天然結(jié)合靶點來減弱剪接因子活性。誘餌寡核苷酸誘導(dǎo)類似于靶標(biāo)剪接因子敲除的轉(zhuǎn)錄組變化，SRSF1誘餌可以限制活體中膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。

另一種方法是使用工程化的U7 snRNA來糾正特定的選擇性剪接事件。這種方法改變了U7對組蛋白mRNA加工的特異性，并對其進(jìn)行重新設(shè)計，以阻斷特定的前mRNA序列，有效地充當(dāng)反義分子。這些構(gòu)建體的穩(wěn)定表達(dá)可以克服傳統(tǒng)反義治療的局限性，因為它們不需要多次給藥。到目前為止，這種方法已用于強直性肌營養(yǎng)不良、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、β－地中海貧血、HIV感染和脊髓肌肉萎縮的模型。

最后，通過基于CRISPR的方法進(jìn)行基因編輯能夠靶向特定的選擇性剪接事件。通過基因編輯，人們可以增強或消除感興趣目標(biāo)中的特定剪接位點序列，從而促進(jìn)外顯子的剪接或跳過。

小結(jié)

過去十年的研究表明，選擇性剪接失調(diào)不僅是癌癥的偶然關(guān)聯(lián)，而是一種幾乎普遍存在的基本分子特征，在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，對普遍存在的癌癥特異性剪接失調(diào)的深入研究，將為我們揭示這種剪接失調(diào)的機(jī)制起源和功能的新見解，并指導(dǎo)我們開發(fā)通過調(diào)節(jié)RNA剪接起作用的新型癌癥治療方法。

參考文獻(xiàn)：

1．RNAsplicing dysregulation and the hallmarks of cancer． Nat Rev Cancer．2023Jan 10

       原文標(biāo)題 : RNA剪接失調(diào)與癌癥