《Biotechnol Bioeng》:耐酸性大腸桿菌利用醋酸鹽生產(chǎn)衣康酸
BACKGROUND INTRODUCTION
利用豐富廉價的碳源可以有效降低生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟(jì)可行性。其中,醋酸鹽就是一種非常有前途的碳源,通常以較高濃度存在于廢物和生物質(zhì)的水解產(chǎn)物中。
衣康酸學(xué)名為甲叉琥珀酸,亞甲基丁二酸,是不飽和二元有機(jī)酸。它含不飽和雙鍵,具有活潑的化學(xué)性質(zhì),可進(jìn)行自身間的聚合,也能與其他單體如丙烯腈等聚合;能進(jìn)行各種加成反應(yīng),酯化反應(yīng)和聚合反應(yīng),是化學(xué)合成工業(yè)的重要原料,也是化工生產(chǎn)的重要原料,可用作酸味劑、pH調(diào)節(jié)劑、金屬螯合劑等。
在2004年,美國能源部將衣康酸評選為12種最具發(fā)展?jié)摿Φ纳镔|(zhì)來源平臺化合物之一。衣康酸主要通過絲狀真菌土曲霉(Aspergillus terreus)的發(fā)酵產(chǎn)生。然而,由于發(fā)酵過程復(fù)雜、菌體生長緩慢、蛋白酶系統(tǒng)復(fù)雜、發(fā)酵過程持續(xù)需氧量高、生產(chǎn)成本高、副產(chǎn)物難以控制,以及缺乏有效的基因工程工具等因素,導(dǎo)致土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸水平受到了限制,40余年里產(chǎn)量都沒有明顯的提升。隨著基因工程、合成生物學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)的飛速發(fā)展,越來越多的研究者將目光聚焦于其他底盤細(xì)胞,將衣康酸合成途徑構(gòu)建在異源細(xì)胞中,如大腸桿菌、酵母細(xì)胞和谷氨酸棒狀桿菌等,以期提升工業(yè)衣康酸的產(chǎn)能。
2018年,韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)(Pohang University of Science and Technology)的Myung Hyun Noh等人,在《Biotechnology and Bioengineering》雜志(IF3.952;工程技術(shù)2區(qū))發(fā)表了題為“Production of itaconic acid from acetate by engineering acid-tolerant Escherichia coli W ”的文章。
所用到的主要方法
METHODS
1.HPLC:采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入色譜柱,對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。適用于溶解后能制成溶液的樣品,不受樣品揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性的限制,用途廣泛。
2.LC-MS:質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化,按離子的質(zhì)荷比分離,然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。液質(zhì)連用實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程,使樣品分析更簡便。
3.real-time PCR:是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異。
4.異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)測定:ICL催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD,NADH在340nm 下有特征吸收峰,監(jiān)測340nm吸光度的減小速率可間接反應(yīng)ICL 活性。
ABSTRACT
利用豐富廉價的碳源可以有效降低生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟(jì)可行性。醋酸鹽是一種很有前途的碳源,可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)有效的微生物轉(zhuǎn)化過程。在這項(xiàng)研究中,作者設(shè)計了一種從醋酸鹽生產(chǎn)衣康酸的大腸桿菌菌株。由于已知醋酸鹽抑制細(xì)胞的生長,作者首先篩選出具有高度耐受醋酸鹽特性的大腸桿菌菌株,并最終選擇W菌株作為后續(xù)研究所用的宿主。隨后,通過使用合成的啟動子和5'UTR(非翻譯區(qū))來過表達(dá)cad基因(編碼順烏頭酸脫羧酶)獲得WC菌株。然而,由于醋酸鹽吸收低,WC菌株僅產(chǎn)生0.13g / L衣康酸。為了改善產(chǎn)量,進(jìn)一步通過途徑基因的過表達(dá)以及其失調(diào)來擴(kuò)增乙酸(即醋酸)同化途徑和乙醛酸分流途徑。所得菌株WCIAG4在用醋酸鹽為唯一碳源發(fā)酵88小時后,可產(chǎn)生3.57g / L衣康酸(理論最大產(chǎn)率的16.1%)。這一研究也表明:醋酸鹽可以成為工程化大腸桿菌生物化學(xué)生產(chǎn)的潛在原料。
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