近年來(lái)，隨著核酸測(cè)序技術(shù)的重大進(jìn)步，將腸道菌群不僅與腸道疾�。ɡ�如炎癥性腸�。┞�(lián)系起來(lái)的研究已顯著增加或結(jié)直腸癌，但也涉及其他廣泛的醫(yī)學(xué)疾病，包括代謝紊亂甚至精神健康疾病。這導(dǎo)致了這樣的假說(shuō)，即通過(guò)糞菌移植對(duì)腸道微生物群的修飾可能在多種疾病中具有治療作用。

糞菌移植是一種治療性干預(yù)措施，其中將來(lái)自一個(gè)或多個(gè)健康供體的糞便處理成糞便漿液（FS），然后輸送到接受者的腸道中。雖然糞菌移植最好是作為復(fù)發(fā)的療法建立艱難梭菌感染，提供了用于炎性病癥的用途糞菌移植的，尤其是潰瘍性結(jié)腸炎。關(guān)注公眾號(hào)：腸道微生態(tài)研究院

盡管其用途越來(lái)越廣泛，但既沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的供體篩查也沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的糞便處理。這種標(biāo)準(zhǔn)化的缺乏延伸到臨床試驗(yàn)，其中有超過(guò)200個(gè)注冊(cè)的使用糞菌移植的，使得結(jié)果難以比較。令人擔(dān)憂的是，糞菌移植還經(jīng)常在私家診所進(jìn)行，甚至由患者本人進(jìn)行，以證實(shí)未經(jīng)證實(shí)的適應(yīng)癥和完全不受管制的方式。

當(dāng)前的糞菌移植糞便處理指南旨在治療艱難梭菌結(jié)腸炎，并且基于缺乏證據(jù)的專家意見。通過(guò)在間隙糞菌移植結(jié)果的確切機(jī)制艱難梭菌在糞便處理協(xié)議從糞便不是已知的，和變化似乎對(duì)糞菌移植的功效用于該適應(yīng)癥影響不大。這導(dǎo)致設(shè)計(jì)用于艱難梭菌的方案在使用糞菌移植作為其他適應(yīng)癥的試驗(yàn)中采用了感染，其作用機(jī)制可能不同。盡管已知暴露于氧氣會(huì)導(dǎo)致許多專性厭氧細(xì)菌感染迅速死亡，但這些方案通常涉及使周圍空氣中的糞便均勻化。

目前，幾乎沒(méi)有證據(jù)可指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇糞便處理方法。通常不嘗試對(duì)已加工的糞菌移植供體材料中的微生物組組成進(jìn)行表征，并且在進(jìn)行該操作時(shí)，通常需要對(duì)提取的糞便DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。這種方法將檢測(cè)源自有活力和無(wú)活力生物體的DNA，因此，指示哪些細(xì)菌具有活力并能夠在受體中復(fù)制的能力有限。培養(yǎng)方法僅能分離出總腸道菌群的一小部分，因此不適合表征加工過(guò)程對(duì)許多常見厭氧菌的影響。

克服這些挑戰(zhàn)的策略是將分子技術(shù)（如下一代測(cè)序和靶向定量PCR分析）與單疊氮化丙啶樣品處理（PMA－qPCR）結(jié)合使用。PMA是一種紅色熒光染料，可選擇性進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞。暴露于光下，PMA將與這些細(xì)胞中的DNA共價(jià)結(jié)合，從而抑制PCR擴(kuò)增。這樣，樣品材料的PMA處理允許僅從樣品中的活細(xì)胞中選擇性擴(kuò)增DNA 。在這項(xiàng)研究中應(yīng)用的PMA－qPCR方法經(jīng)過(guò)特別優(yōu)化，可用于糞便中進(jìn)行移植，并與培養(yǎng)方法進(jìn)行了比較。

我們報(bào)告厭氧均質(zhì)化，有氧均質(zhì)化和凍融對(duì)糞便微生物群處理的供體糞便中細(xì)菌的活力和功能能力的影響。

糞菌移植糞便（FS）處理

從糞便中收集糞便作為糞菌移植供體進(jìn)行臨床試驗(yàn)。所有捐助者都通過(guò)了篩選調(diào)查表，用于確定潛在的糞菌移植捐助者。在現(xiàn)場(chǎng)收集糞便，并在15分鐘內(nèi)進(jìn)行處理。將凳子分成兩等份，重至少30 g。將每個(gè)等分試樣（在240 V Waring SS515實(shí)驗(yàn)室混合器中以22，000 rpm的速度）與生理鹽水（NS）和甘油混合，以產(chǎn)生由25％（wt ／ vol）糞便，65％NS和10％糞便組成的糞便漿液（FS）。如前所述甘油。在第一等份（ANO 2糞便混合和PMA處理在厭氧室內(nèi)的厭氧條件下進(jìn)行。在第二等分試樣中，在環(huán)境空氣中執(zhí)行相同的步驟。將所得的FS在－80 o C的50 mL離心管中冷凍。為了評(píng)估凍融的效果，將厭氧處理過(guò)的FS的50 mL等分試樣在－80 o C下儲(chǔ)存？48 h，然后在室溫下于厭氧室內(nèi)融化。在處理或PMA處理期間，凍融的樣品未暴露于氧氣。熱殺傷通過(guò)使解凍FS的1毫升等分至99進(jìn)行℃30分鐘。

新鮮，冷凍，解凍和熱滅活的FS的稀釋和PMA處理

緊接上述過(guò)程之后，將純凈的FS（糞便含量的25％）在磷酸鹽緩沖液（PBS）中稀釋100倍，并在無(wú)RNase的1．5 mL透明試管中分成6個(gè)95μL等分試樣美國(guó)馬薩諸塞州）。如上所述，在有和沒(méi)有PMA的情況下，一式三份處理稀釋的樣品。將樣品保存在－80提取之前℃。PMA處理是使用專門開發(fā)的協(xié)議進(jìn)行的，并已針對(duì)糞便進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)將1 mg PMA（Biotium Inc．，F(xiàn)remont，CA，USA）溶解在1 mL 20％二甲基亞砜中來(lái)制備PMA儲(chǔ)備液。對(duì)于PMA處理，將5μLPMA儲(chǔ)備液添加到95μL樣品中以達(dá)到100μMPMA終濃度。在室溫下于黑暗中孵育30分鐘后，將樣品暴露于LED燈（Aqua Zonic，新加坡）中20分鐘。在未經(jīng)PMA處理的對(duì)照等分試樣中，添加5μLPBS代替PMA。對(duì)照樣品與匹配的PMA處理的樣品進(jìn)行相同的孵育和曝光。

微生物組成的測(cè)定

從整個(gè)（100μL）未紡樣品中提取DNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用PowerLyzer PowerSoil DNA分離試劑盒（MO BIO實(shí)驗(yàn)室，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國(guó)）提取DNA，并保存在－20o C下。
通過(guò)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4高變區(qū)進(jìn)行配對(duì)末端測(cè)序，確定糞便樣本的微生物組成。如前所述，在Illumina MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行了擴(kuò)增子測(cè)序。配對(duì)末端讀段使用先前描述的生物信息學(xué)流水線［合并，解復(fù)用，并使用到微生物生態(tài)學(xué)（QIIME）軟件（v1．9．1的）定量數(shù)據(jù)分析進(jìn)行分析。使用針對(duì)97％相似度聚類的SILVA 16S rRNA參考數(shù)據(jù)庫(kù)（版本128）的開放參考方法，將序列分配給操作分類單位（OTU）。對(duì)所有樣本進(jìn)行二次采樣，深度達(dá)到6188個(gè)序列讀數(shù)。使用QIIME計(jì)算用于確定分類單元豐富度（觀察物種）和多樣性（PD整棵樹）的alpha多樣性指標(biāo)。

將所有樣本中零計(jì)數(shù)的分類單元?dú)w一化為單一計(jì)數(shù)。通過(guò)計(jì)算相對(duì)于所有分類群中厭氧處理的匹配對(duì)照的相對(duì)豐度倍數(shù)變化的log2值，確定分類群相對(duì)豐度的變化。根據(jù)log2倍變化總和的反對(duì)數(shù)除以檢測(cè)到分類單元的供體數(shù)，計(jì)算出分類群相對(duì)豐度平均倍數(shù)變化。分析中僅包括每個(gè)供體中至少一個(gè)對(duì)照組中存在的細(xì)菌類群（序列計(jì)數(shù)≥2），并且在8個(gè)供體中至少7個(gè)中存在。

物種特異性細(xì)菌計(jì)數(shù)

總細(xì)菌水平，丁酰－CoA：乙酸CoA－轉(zhuǎn)移酶基因，厭食厭氧桿菌，普氏桿菌，哈里氏桿菌，羅斯伯氏菌／真細(xì)菌，雙歧桿菌。Alistipes putredinis和Bacteriodes spp。使用QuantStudio 6實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA），使用先前描述的qPCR測(cè)定法（在補(bǔ)充表1中詳述）測(cè)定DNA。該Subdoligranulum變量qPCR分析是作為這項(xiàng)研究的一部分（見補(bǔ)充方法）。大腸桿菌使用基于探針的測(cè)定法，使用KAPPA PROBE FAST ROX Low Master Mix試劑（南非開普敦，Kapa Biosystems）擴(kuò)增DNA。使用SYBR綠色熒光試劑（PowerUp SYBR Green Master Mix，Applied Biosystems）進(jìn)行所有其他PCR測(cè)定。定量PCR測(cè)定法為丁酰輔酶A：乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因，苛養(yǎng)菌，包括A． hadrus，霍氏真桿菌，羅斯氏／ E。直腸和S．變量，從供體糞便中提取的DNA的10倍稀釋系列用作陽(yáng)性qPCR標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)將在PMA存在下擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)量除以在匹配的未處理對(duì)照中擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)量來(lái)確定每個(gè)樣品中存活的細(xì)菌細(xì)胞的比例。為了確定在熱滅活的標(biāo)本中可行的比例，將在經(jīng)過(guò)PMA處理的熱滅活的樣品中擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)量除以在熱滅活之前的對(duì)照樣品中擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)量。熱滅活的標(biāo)本用作陰性對(duì)照，代表在不可行標(biāo)本中預(yù)期的擴(kuò)增水平。

代謝組學(xué)功能評(píng)估

如前所述，我們使用體外發(fā)酵模型評(píng)估了差異處理的糞便漿料的功能能力。當(dāng)與發(fā)酵底物高直鏈玉米玉米淀粉（HAMS）孵育時(shí)，該方法評(píng)估樣品中微生物群產(chǎn)生SCFA的能力。簡(jiǎn)而言之，將已如前所述處理過(guò)的ANO 2或O 2的糞菌移植供體（n ＝ 8）的冷凍糞便糞便樣品解凍，并在嚴(yán)格的厭氧條件下與HAMS一起孵育。加熱殺菌的糞便漿料（n ＝ 2）和HAMS（n＝ 2）用作陰性對(duì)照。通過(guò)火焰離子化檢測(cè)的氣相色譜法（Hewlett－Packard6890； Palo Alto，CA，USA）測(cè)定SCFA水平。孵育前和在37°C搖動(dòng)厭氧孵育24小時(shí)后，測(cè)量乙酸，丁酸和丙酸水平。使用4－甲基戊酸（Sigma－Aldrich）作為內(nèi)標(biāo)對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用Wilcoxon配對(duì)對(duì)的符號(hào)秩檢驗(yàn)比較兩組中的SCFA產(chǎn)生

統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 7．03軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性（p值＜0．05）使用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行確定，而Wilcoxon配對(duì)對(duì)有符號(hào)秩檢驗(yàn)用于非參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行確定。

供體特征

捐助者的中位年齡為28．5歲（21－41歲），男女比例相等。相同數(shù)量的捐助者具有東南亞和歐洲遺產(chǎn)（補(bǔ)充表2）。

加工方法對(duì)糞便中細(xì)菌活力的影響
立即進(jìn)行厭氧處理后，F(xiàn)S中存活細(xì)菌的平均比例為0．50±0．24（平均值±SD）。在環(huán)境空氣中處理后，該比例下降到0．19±0．07，在厭氧處理后進(jìn)行一個(gè)凍融循環(huán)后，該比例為0．23±0．11。？與單獨(dú)的厭氧處理相比，在環(huán)境空氣中處理后（p ？＝ 0．007）和凍融后（p ＝ 0．027），觀察到存活的細(xì)菌細(xì)胞比例顯著降低。在所有加工方法中，活細(xì)菌的比例均大于在熱滅活的標(biāo)本中檢測(cè)到的比例（p＞ 0．001）。

使用16S rRNA基因qPCR結(jié)合PMA處理確定為可行的細(xì)菌比例。通過(guò)將在PMA處理的樣品中擴(kuò)增的活細(xì)胞除以在未經(jīng)PMA處理的對(duì)照樣品中擴(kuò)增的細(xì)胞總數(shù)，來(lái)確定活細(xì)胞的比例。在新鮮需氧條件下（ANO 2），新鮮需氧條件下（O 2），在厭氧處理過(guò)的標(biāo)本中冷凍和解凍一個(gè)周期（FT1）或在熱殺死后（HK），評(píng)估糞便中的細(xì)菌生存力。（條形圖表示8個(gè)供體糞便樣本的平均值±SD＝ p ＜0·05， ＝ p ＜0·01；成對(duì)t檢驗(yàn)）。

微生物群的多樣性

在PMA處理后，在厭氧條件下處理的標(biāo)本中檢測(cè)到的活類群多樣性明顯低于使用標(biāo)準(zhǔn)方法（無(wú)PMA）處理的標(biāo)本（圖2； 分類群豐富度：p ＜0．001；PD整棵樹：p＝ 0．007）。與ANO 2處理（p＝ 0．023）或FT樣品（p＝ 0．023）相比，在環(huán)境空氣（O 2）中處理后，觀察到的可行分類單元豐富度顯著降低。ANO 2和FT組之間沒(méi)有觀察到多樣性差異。O 2和ANO 2之間以及O 2和FT組之間的PD整樹多樣性差異不顯著。

通過(guò)16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序評(píng)估有無(wú)PMA處理后來(lái)自8個(gè)供體的糞便微生物群移植材料的分類單元豐富度。存活多樣性（PMA處理組）顯著低于對(duì)照樣本中觀察到的多樣性，即使在厭氧條件下立即處理的樣本中（＝ p ＜0·001，成對(duì)t檢驗(yàn)）。當(dāng)僅比較在厭氧條件下（ANO 2），環(huán)境空氣（O 2）或在厭氧處理的樣品（FT1）冷凍和融化一個(gè)周期后處理的樣品之間的可行多樣性時(shí)，在處理過(guò)的O 2樣品中觀察到的物種明顯較低，而標(biāo)本的凍融并沒(méi)有顯著降低多樣性，箱形圖表示中位數(shù)和IQR，誤差線表示最小值到最大值；＝ p ＜0·05； Wilcoxon配對(duì)配對(duì)簽署等級(jí)測(cè)試）。

可行的微生物群組成

在所有樣品中顯示最大相對(duì)豐度的五個(gè)分類單元（OTU）分別屬于擬桿菌屬，普氏桿菌屬，雙歧桿菌屬，費(fèi)氏桿菌屬和漆螺菌科（平均相對(duì)豐度分別為0．21、0．09、0．05、0．05和0．05）。為了確定哪個(gè)類群受環(huán)境氧氣或凍融處理的影響最大，按相對(duì)豐度倍數(shù)變化對(duì)類群進(jìn)行排序。在環(huán)境空氣中處理后，有19個(gè)分類單元的相對(duì)豐度下降了2．5倍或更多，而凍融組中只有2個(gè)分類單元。受環(huán)境空氣處理影響最大的分類單元包括Faecalibacterium，Subdoligranulum，Eubacterium hallii，reeutale，Roseburia和Anaerostipes，它們代表了健康人類腸道微生物群中主要的丁酸酯生產(chǎn)分類單元。埃希氏菌－志賀氏菌和阿利斯提比斯是唯一的類群，在環(huán)境氧氣或凍融條件下相對(duì)豐度增加了2．5倍或更多，并且僅在環(huán)境空氣中處理后才觀察到。

在環(huán)境空氣中處理后（O 2對(duì)ANO 2）或在凍融后（FT1對(duì)ANO 2），存活的分類單元的相對(duì)豐度變化。淺灰色條表示相對(duì)豐度降低，深灰色條表示相對(duì)豐度升高。選定的細(xì)菌類群通過(guò)qPCR進(jìn)一步評(píng)估（箭頭）。僅描繪了相對(duì)豐度變化至少2·5倍的分類單元。

為了證實(shí)在分類單元相對(duì)豐度中觀察到的變化，通過(guò)定量PCR確定了上面列出的受處理嚴(yán)重影響的分類單元的絕對(duì)水平。這包括對(duì)所有主要丁酸鹽生產(chǎn)者的相對(duì)豐度進(jìn)行≥2．5倍的評(píng)估，以及對(duì)那些總體流行率最高的分類單元（細(xì)菌／ Prevetolla和雙歧桿菌屬）的評(píng)估。與相同組的標(biāo)準(zhǔn)分析相比，厭氧處理組中活菌（經(jīng)PMA處理）的相對(duì)細(xì)菌數(shù)量的變化在補(bǔ)充資料中顯示。

靶向擴(kuò)增活微生物

通過(guò)使用靶向定量PCR分析，可以確定屬于特定細(xì)菌物種的活細(xì)胞的比例。用于測(cè)定F． prausnitzii，S．變量，A． hadrus，霍氏真桿菌，和羅斯氏／ E．直腸包括作為這些類群表明＞在相對(duì)豐度2．5倍或更大的下降以下在環(huán)境空氣中處理。細(xì)菌桿菌／普氏桿菌的測(cè)定。和雙歧桿菌屬。由于這些是我們隊(duì)列中相對(duì)豐度最高的屬，因此也進(jìn)行了研究。每種加工條件下各個(gè)供體的結(jié)果見補(bǔ)充表3a–c。

通過(guò)特定的qPCR分析確定為可行的細(xì)菌比例。通過(guò)將在PMA處理的樣品中擴(kuò)增的活細(xì)胞除以在未經(jīng)PMA處理的對(duì)照樣品中擴(kuò)增的細(xì)胞總數(shù)來(lái)確定活細(xì)胞的比例。在新鮮厭氧條件，新鮮需氧條件下處理，在厭氧處理后的標(biāo)本中冷凍和解凍一個(gè)周期（FT1）或在熱殺死后（HK），評(píng)估糞便中的細(xì)菌生存力。箱形圖描繪了中位數(shù)和IQR，誤差棒描繪了來(lái)自8個(gè)單獨(dú)供體的糞便樣本的最小值至最大值。所有重要的比較均以星號(hào)表示（＝ p ＜0·05；＝ p ＜0·01；＝ p＜0·001；Wilcoxon配對(duì)配對(duì)簽署等級(jí)測(cè)試）。

觀察到對(duì)除了所有類群以下環(huán)境空氣處理活細(xì)菌的水平顯著減少羅斯氏／ E．直腸E（，觀察其處理的無(wú)顯著影響）。在F． prausnitzii的情況下，O 2組中活菌的比例與熱滅活的等分試樣沒(méi)有顯著差異。冷凍融化后，哈氏腸桿菌是唯一顯示絕對(duì)生存水平顯著降低的物種。

進(jìn)行了大腸桿菌絕對(duì)豐度的評(píng)估，因?yàn)樵摲诸悊卧�顯示了在環(huán)境空氣中處理后相對(duì)豐度的最大增加。除一個(gè)人外，其他所有捐獻(xiàn)者中大腸桿菌的絕對(duì)擴(kuò)增均低于定量閾值，不同處理方法之間無(wú)顯著差異（補(bǔ)充表3a－c）。阿利斯皮犬在環(huán)境空氣中處理后也顯示出相對(duì)豐度增加，但絕對(duì)豐度沒(méi)有增加。

使用半定量PCR方法估算丁酸CoA：乙酸酯CoA轉(zhuǎn)移酶基因（丁酸生物合成的主要途徑中的末端酶）編碼基因在活細(xì)菌細(xì)胞中的運(yùn)輸（這被用作替代方法）。丁酸酯的整體生物合成能力）。當(dāng)比較在環(huán)境空氣中處理的活細(xì)胞的擴(kuò)增時(shí)，該酶的水平顯著低于從厭氧處理的樣品（p ？＝ 0．012）或凍融樣品（p ？＝ 0．001）的活細(xì)胞中檢測(cè)到的酶水平。在環(huán)境空氣中處理的活細(xì)胞中檢測(cè)到的丁酰輔酶A：乙酸酯輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的水平相當(dāng)于已被熱殺死的樣品。

在一輪冷凍和冷凍后，在新鮮厭氧條件下（ANO 2），新鮮需氧條件下（O 2）擴(kuò)增人腸道菌群中丁酸中心合成途徑的末端酶－丁酰－CoA：乙酸鹽CoA－轉(zhuǎn)移酶基因。在經(jīng)過(guò)PMA處理的樣品中，在厭氧處理的標(biāo)本（FT1）中或在熱殺死后（HK）解凍。相對(duì)于純糞便漿液（FS對(duì)照）的10倍稀釋系列中的擴(kuò)增，測(cè)量了丁酰輔酶A（CoA）CoA轉(zhuǎn)移酶基因水平。虛線代表測(cè)定的定量極限。箱形圖描繪了中值和IQR，誤差線描繪了來(lái)自8個(gè)個(gè)體供體的糞便樣本的最小值至最大值。明顯的比較用星號(hào)表示。（＝ p＜0·05； ＝p ＜0·01；＝ p ＜0·001；Wilcoxon配對(duì)配對(duì)簽署等級(jí)測(cè)試）。

SCFA生物合成

后發(fā)酵SCFA水平的成對(duì)比較表明微生物butyrogenic和產(chǎn)乙酸容量時(shí)供體糞便是在環(huán)境空氣（經(jīng)處理的O操作被顯著減少2 VS ANO 2，p ＝ 0．008和p ？＝ 0．016分別圖6）。相比之下，丙酸生物合成的顯著變化與氧氣暴露無(wú)關(guān)。

用高直鏈玉米玉米淀粉對(duì)糞菌移植糞便進(jìn)行體外發(fā)酵后，丁酸和醋酸鹽的凈產(chǎn)量。匹配的樣品（n ＝ 8）在厭氧條件下（ANO 2）或在有氧條件下（O 2）處理。明顯的比較用星號(hào)表示。（＝ p ＜0·05； ＝ p ＜0·01； Wilcoxon匹配對(duì)有符號(hào)秩檢驗(yàn)）。

目前，沒(méi)有什么證據(jù)可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生使用糞菌移植如何最好地確保在糞便移植材料中保留供體微生物的生存能力。供體材料中微生物群的分析不是常規(guī)操作，執(zhí)行時(shí)，所用方法無(wú)法評(píng)估生存力。基于PMA的方法能夠克服評(píng)估糞便中精煉細(xì)菌復(fù)雜群體生存能力的許多挑戰(zhàn)。然而，PMA方法的主要局限性在于它容易高估樣品中活細(xì)菌的數(shù)量。這意味著存活細(xì)胞的數(shù)量可能少于我們報(bào)告的數(shù)量。此外，對(duì)PMA處理所需的標(biāo)本進(jìn)行稀釋意味著將非常稀有的類群排除在這種類型的分析之外。
盡管存在這些局限性，但我們表明，報(bào)告糞菌移植材料中存在的微生物群的當(dāng)前方法明顯高估了移植的活細(xì)菌的數(shù)量。平均而言，在嚴(yán)格的厭氧條件下立即處理后，在我們的研究中，糞便移植物中只有一半的細(xì)菌仍然可以存活。PMA樣品處理的使用還表明，這些移植物中細(xì)菌的多樣性明顯少于使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法所報(bào)道的細(xì)菌多樣性。

我們觀察到供體間的實(shí)質(zhì)性差異對(duì)樣品處理的影響�？梢酝ㄟ^(guò)微生物組組成的個(gè)體差異來(lái)解釋這種差異，從而導(dǎo)致微生物群落對(duì)氧氣的暴露和凍結(jié)具有不同的脆弱性，并表明需要對(duì)所有供體材料進(jìn)行活力評(píng)估。

我們的研究表明，通過(guò)在環(huán)境空氣中混合糞便而使其均質(zhì)化對(duì)其生存細(xì)菌組成產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在大多數(shù)臨床試驗(yàn)中，環(huán)境空氣處理是默認(rèn)操作，在美國(guó)，英國(guó)和歐洲共識(shí)性指南中都有描述，盡管在許多規(guī)程中，糞便是手動(dòng)均質(zhì)的，沒(méi)有像本研究那樣混合。與手動(dòng)均質(zhì)化相比，在高速混合過(guò)程中產(chǎn)生的增加的空氣流量可能會(huì)導(dǎo)致氧氣暴露增加，并且對(duì)氧氣敏感物種更加有害。

受氧暴露影響最大的專性厭氧腸共生種，是丁酸生物合成的主要貢獻(xiàn)者，包括費(fèi)氏桿菌，變數(shù)亞種，真細(xì)菌，哈里氏桿菌和厭氧厭食菌。丁酸鹽是一種由腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸。除了是結(jié)腸的，丁酸鹽的主要能量源，并具有二者的抗炎和抗致癌特性。降低的腔內(nèi)丁酸酯濃度或丁酸酯利用率與腸細(xì)胞三磷酸腺苷的消耗，緊密連接的喪失，粘液產(chǎn)生減少以及由此產(chǎn)生的結(jié)腸屏障破壞有關(guān)，具有炎癥和免疫學(xué)后果。

我們觀察到在大多數(shù)供體中可行的F． prausnitzii和A． hadrus的比例，以及丁酰輔酶A：乙酸酯輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的水平降低到在熱滅活的標(biāo)本中檢測(cè)到的水平。在氧氣存在下進(jìn)行處理。腸道內(nèi)產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌，特別是F． prausnitzii的相對(duì)減少與多種慢性疾病的存在有關(guān)，包括抑郁癥，肥胖癥，2型糖尿病和炎癥性腸病疾病。這些發(fā)現(xiàn)表明，在環(huán)境空氣中處理糞便可能會(huì)對(duì)使用糞菌移植實(shí)現(xiàn)抗炎或免疫調(diào)節(jié)結(jié)果的努力產(chǎn)生負(fù)面影響。

雙歧桿菌屬和擬桿菌屬分別是短鏈脂肪酸的主要生產(chǎn)者，乙酸鹽和丙酸鹽，并且像丁酸鹽一樣是重要的能量和信號(hào)分子。盡管它們的有益作用還不如丁酸酯，但這些代謝物還是重要的免疫和代謝調(diào)節(jié)劑。暴露于氧氣后，這些屬的成員的豐度也顯著降低。但是，仍然存在大量的剩余存活種群，特別是在擬桿菌屬的情況下。表明接受者的內(nèi)臟可能會(huì)再次擴(kuò)張。

盡管冷凍確實(shí)會(huì)降低移植材料的整體生存能力（將整體生存能力降低至約25％），但可行的微生物群組成與經(jīng)過(guò)厭氧處理的新鮮標(biāo)本沒(méi)有顯著差異。在冷凍融化的標(biāo)本中，僅發(fā)現(xiàn)一種細(xì)菌，即哈氏真細(xì)菌（Eubacterium hallii）顯著減少。盡管哈氏腸桿菌是主要的丁酸酯生產(chǎn)者，但該功能也由其他幾種細(xì)菌執(zhí)行。該單一物種喪失的潛在臨床意義尚不確定。

除了通過(guò)在環(huán)境空氣中處理而使糞便中的有益共生細(xì)菌耗竭之外，潛在致病物種（例如大腸桿菌和其他耐氧革蘭氏陰性細(xì)菌）的相對(duì)豐度也會(huì)成比例增加。在我們的供者隊(duì)列中，大腸桿菌水平新鮮糞便含量非常低，沒(méi)有證據(jù)表明加工過(guò)程中絕對(duì)豐度增加。但是，樣品處理的延遲會(huì)導(dǎo)致在室溫下延長(zhǎng)時(shí)間，這可能會(huì)導(dǎo)致大量機(jī)會(huì)病原體大量增加。丁酸產(chǎn)生厭氧菌具有耐氧物種的過(guò)度生長(zhǎng)合并的損失可能會(huì)從健康供體的變換糞便移植材料進(jìn)入糞便材料與微生物群分布更緊密地類似于那些與炎性腸病，2型糖尿病和大腸癌。

在厭氧室內(nèi)處理糞菌移植材料可實(shí)現(xiàn)重要共生物種的最佳保存。在艱難梭菌的背景下結(jié)腸炎，好氧處理似乎不會(huì)對(duì)臨床結(jié)果產(chǎn)生不利影響。但是，在對(duì)糞菌移植進(jìn)行其他適應(yīng)癥的調(diào)查時(shí)，應(yīng)該嘗試最佳保存共生菌，而尚不清楚共生厭氧菌的損失如何影響臨床結(jié)果。我們研究的局限性在于沒(méi)有分析加工延遲的影響。盡管在這項(xiàng)研究中糞便標(biāo)本在15分鐘內(nèi)進(jìn)行了處理，但這在大多數(shù)臨床環(huán)境中是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，并且延遲幾個(gè)小時(shí)的處理更為典型。這種處理上的延遲可能導(dǎo)致活菌群組成的改變。先前許多采用分子策略的研究都報(bào)告，糞便分析的延遲與微生物群組成和生存力的變化有關(guān)等人評(píng)估了最多7個(gè)小時(shí)的增量時(shí)間延遲后，一位供體中糞菌移植材料的變化，并觀察到了這段時(shí)間內(nèi)微生物組組成發(fā)生變化的趨勢(shì)。這些報(bào)告得到了許多基于文化的研究的支持，這些研究表明，當(dāng)處理延遲時(shí)，特別是在室溫下，并且樣品沒(méi)有在厭氧條件下存儲(chǔ)時(shí)，厭氧菌的回收率會(huì)降低。在進(jìn)一步研究澄清影響或處理延遲之前，我們建議樣品收集和處理之間的時(shí)間越短越好。

處理后，糞便應(yīng)立即在－80°C下冷凍。在滴注之前將樣品冷凍的能力很重要，因?yàn)樗鼮橥瓿砂�括病毒和寄生蟲在內(nèi)的病原體的系統(tǒng)測(cè)試提供了機(jī)會(huì)。冷凍還可以根據(jù)需要提供大便，以用于緊急臨床情況。我們的分析表明，盡管凍融確實(shí)會(huì)影響糞便的存活組成，但總體而言，這種作用相對(duì)有限。但是，各個(gè)供體微生物群對(duì)凍結(jié)的反應(yīng)存在差異。在這項(xiàng)研究中，兩個(gè)供體的總體細(xì)菌生存力下降到單獨(dú)冷凍融化后環(huán)境空氣處理后的水平以下。

在糞菌移植臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中，糞便加工在改變糞便移植物成分方面所起的作用已被廣泛忽略。堅(jiān)持嚴(yán)格的厭氧糞便處理協(xié)議可能會(huì)導(dǎo)致在某些臨床情況下糞菌移植的收益增加。其他因素，例如糞便處理和儲(chǔ)存條件的延遲，可能對(duì)細(xì)菌生存力的影響與厭氧處理一樣大，但在本研究中未進(jìn)行評(píng)估。用生存力測(cè)定法評(píng)估供體移植材料的組成，以確保微生物群組成包括范圍廣泛的活菌，其中一些對(duì)介導(dǎo)糞菌移植的治療作用可能至關(guān)重要，這對(duì)將來(lái)的試驗(yàn)將是有益的。