3． 創(chuàng)新藥物

凋亡誘導(dǎo)劑（Bcl－xL抑制劑）

抗凋亡Bcl－2家族成員（包括Bcl－xL）的過度表達(dá)是癌細(xì)胞獲得凋亡抵抗的機(jī)制之一。能夠阻斷Bcl－xL上BH3結(jié)合域的藥物可以觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL－xL抑制劑的有效載荷，其靶向表達(dá)EGFR的特定細(xì)胞或組織。有趣的是，研究人員在有效載荷上使用了三個(gè)不同的連接點(diǎn)來連接可切割的連接子。氨基烷基延伸的核心修飾用于在需要時(shí)建立合適的連接位點(diǎn)。

泰蘭司他丁及其類似物

靶向剪接體是一種參與mRNA加工的大型核糖核蛋白復(fù)合物，為靶向癌癥治療提供了一種有希望的治療選擇。有幾種天然產(chǎn)物能夠通過與不同的剪接體亞單位結(jié)合來抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以與剪接體的SF3b亞單位結(jié)合，從而阻止RNA剪接。

Thailanstatin A缺乏一個(gè)適合連接連接子的基團(tuán)。為了解決這個(gè)問題，將羧酸與乙二胺偶聯(lián)以引入含有胺的間隔基，該間隔基通常用于連接子的安裝。

將這種天然產(chǎn)物用于ADC的另一個(gè)困難是存在多種反應(yīng)性功能。例如，中心核中的二烯可以通過Diels–Alder反應(yīng)與用于生物結(jié)合的馬來酰亞胺部分反應(yīng)。這個(gè)問題是通過使用另一個(gè)共軛部分，鹵代乙酰胺來解決的。結(jié)合這兩種修飾并包含可切割連接子的ADC首次在專利文獻(xiàn)中報(bào)道，并且聲稱它們?cè)趲讉�(gè)表達(dá)HER2的細(xì)胞系中具有適度的活性。

最近，輝瑞報(bào)告說，羧酸直接與抗體的有效表面賴氨酸（無連接子偶聯(lián)）結(jié)合導(dǎo)致迄今為止最有效的Thailanstatin ADC。這些賴氨酸偶聯(lián)物的活性與藥物負(fù)載有關(guān)，而其他有效載荷類通常沒有觀察到這種特性。ADCs在胃癌異種移植模型中顯示出良好的作用。

鵝膏毒素

在ADC技術(shù)領(lǐng)域，使用類似amatoxins的轉(zhuǎn)錄抑制劑是一種相對(duì)較新的方法。九種天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架結(jié)構(gòu)，一個(gè)由八個(gè)L－構(gòu)型氨基酸組成的大環(huán)，通過亞砜部分連接在色氨酸和半胱氨酸殘基之間。amatoxins的三個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)橇u基化的，OH基團(tuán)具有良好的水溶性并與目標(biāo)分子結(jié)合。兩種肽，α－鵝膏糖蛋白和β－鵝膏毒素，占所有毒素的90％。

在amatoxins上共使用過三個(gè)附著點(diǎn)產(chǎn)生ADC。第一次嘗試是將β－鵝膏毒素的羧基偶聯(lián)到IgG上賴氨酸的氨基，這種連接具有良好的血漿穩(wěn)定性和高細(xì)胞毒性，但這種生物偶聯(lián)的產(chǎn)率很低。二氫異亮氨酸的羥基也被認(rèn)為是一個(gè)連接點(diǎn)，引入谷胱甘肽作為連接子，然后通過賴氨酸結(jié)合，可獲得體外細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性優(yōu)異的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解連接子，導(dǎo)致其循環(huán)穩(wěn)定性差。第三種方法，附著于色氨酸的6－羥基代表了目前的標(biāo)準(zhǔn)程序，苯酚與各種連接子的醚化導(dǎo)致了高度穩(wěn)定和有效的ADC。由于鵝膏毒素其它氨基酸要么不具化學(xué)活性，要么是與RNA聚合酶II結(jié)合的關(guān)鍵，因此不能將其它的鵝膏毒素氨基酸（即羥脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和半胱氨酸）用于偶聯(lián)。

基于amanitin的代表性的ADC為HDP－101。有效載荷本身是一種合成的金剛烷醇衍生物，優(yōu)化了穩(wěn)定性。與天然天麻素相比，兩個(gè)差異是色氨酸中沒有6′－OH，硫醚鏈取代亞砜。通過天冬氨酸側(cè)鏈上酰胺的形成，引入組織蛋白酶B－裂解連接子。

最近，Park及其合作者為含苯酚的有效載荷設(shè)計(jì)了一種新的連接基序（OHPAS）。它是一種二芳基硫酸鹽，一個(gè)芳基部分來自有效載荷，另一個(gè)來自連接基序的潛在苯酚基團(tuán)。將該技術(shù)應(yīng)用于曲妥珠單抗ADC中的a－鵝膏毒素，在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性。

煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）是一種負(fù)責(zé)將煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酰胺單核苷酸的酶，其抑制劑在各種臨床前和臨床研究中顯示出有效性，但其臨床應(yīng)用受到靶向毒性和劑量限制性毒性的限制，如血小板減少和胃腸道不良反應(yīng)。

諾華公司的研究人員在NAMPT抑制劑有效載荷中的苯環(huán)對(duì)位中引入哌嗪部分，確定了合適的連接子附著點(diǎn)。這種分子在c－Kit和HER2表達(dá)細(xì)胞系上表現(xiàn)出納摩爾水平的效力，并且耐受性良好，在體內(nèi)表現(xiàn)出靶向依賴性。

卡馬霉素

從庫拉索菌中分離得到兩種新的蛋白酶抑制劑，卡馬霉素A和卡馬霉素B。兩者都具有亮氨酸衍生的α，β－環(huán)氧酮彈頭直接連接到甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜。他們被發(fā)現(xiàn)能抑制釀酒酵母20S蛋白酶β5亞單位活性（糜蛋白酶樣活性）。此外，它們對(duì)肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞株具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

然而，由于它們的高效價(jià)，它們的選擇性較差，經(jīng)常表現(xiàn)出毒副作用。因此，劇毒的卡馬霉素衍生物適合作為ADC的彈頭，可以保持所需的效力，并獲得更好的耐受性。所設(shè)計(jì)的類似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡馬霉素B），而不是卡馬霉素A中的亞砜甲硫氨酸，因?yàn)檫@消除了亞砜基立體異構(gòu)體混合物產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。

第一代類似物在P4末端含有胺基，不幸的是，這個(gè)附著點(diǎn)并不合適，因?yàn)橛行лd荷顯示細(xì)胞毒性活性降低。第二代卡馬霉素類似物在P2側(cè)鏈上含有一個(gè)胺基，當(dāng)短乙基氨基鏈延伸磺�；鶗r(shí)，效果最好。在第三代類似物中，芳基連接砜和胺，因此降低了它的堿性。第二代和第三代有效載荷都顯示出強(qiáng)大的體外活性，并用可切割或不可切割的連接子連接。不幸的是，沒有一種ADC對(duì)受試癌細(xì)胞系表現(xiàn)出比曲妥珠單抗更高的細(xì)胞殺傷能力。

連接子

連接子不僅是抗體與小分子有效載荷之間形成共價(jià)連接的分子部分，而且是靶向藥物治療中具有設(shè)計(jì)性質(zhì)的關(guān)鍵元件。連接子的加入不應(yīng)誘導(dǎo)聚集，并且需要確�？山邮艿腜K特性，同時(shí)限制有效載荷在血漿中的過早釋放（穩(wěn)定性），并使活性分子在靶向作用位點(diǎn)有效釋放。連接子分為兩類：不可切割型和可切割型。

1． 不可切割連接子

基于不可切割的連接子的ADC必須被內(nèi)化，抗體部分需要被溶酶體蛋白酶降解以釋放活性分子。在ADC開發(fā)過程中已經(jīng)探索了許多不可切割的連接子，最具代表性的是N－琥珀酰亞胺基－4－（N－馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷－1－羧酸鹽（SMCC），Kadcyla就是使用的此類型連接子。

這種結(jié)構(gòu)的分解代謝導(dǎo)致Lys－SMC－DM1成為主要的腫瘤代謝物。此外，與這種連接子相連的藥物通常不能發(fā)揮旁觀者效應(yīng)，因?yàn)獒尫诺姆纸獯�謝產(chǎn)物通透性較差。目前的研究主要集中在可切割的連接子上。

使用可切割連接子對(duì)于具內(nèi)化和不具內(nèi)化ADC的設(shè)計(jì)同樣可行，因?yàn)獒尫攀怯汕懈钗稽c(diǎn)（溶酶體和／或腫瘤環(huán)境）的性質(zhì)觸發(fā)的。連接子可以分為兩大類：酶依賴性和化學(xué)（即非酶）依賴性。

2． 化學(xué)依賴性連接子

含有二硫鍵的連接子受到硫醇的親核攻擊以釋放活性載荷。盡管血漿中人血清白蛋白（HSA）的還原形式就是最豐富的硫醇，但它對(duì)大分子的反應(yīng)性很差。胞漿中還含有高水平的谷胱甘肽（GSH），這是一種含有巰基的三肽，很容易與S－親核蛋白發(fā)生反應(yīng)。血液（微摩爾范圍）和細(xì)胞質(zhì)（毫摩爾范圍）中GSH濃度的差異以及癌細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激有助于藥物在癌細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先釋放。含有二硫鍵的連接子主要與maytansinoid類有效載荷相關(guān)。二硫鍵的反應(yīng)性可由空間位阻調(diào)節(jié)：α－甲基替換顯著影響還原速率和對(duì)硫醇－二硫鍵交換的抗性，如SAR－3419的連接子通過偕二甲基替換獲得SPDB－DM4最佳的抗腫瘤活性。

腙連接子顯示出依賴于pH的穩(wěn)定性，在中性pH下穩(wěn)定，并在酸性介質(zhì)中水解（內(nèi)體的pH＜6，溶酶體的pH＜5），形成相應(yīng)的酮和肼。

該方法已成功應(yīng)用于IMMU－110，包含一個(gè)可裂解�；�腙連接子，由4－馬來酰亞胺甲基環(huán)己烷－1－羧酸鹽（MCC）的酰肼與阿霉素中存在的酮基反應(yīng)中形成。

腙連接體也經(jīng)常用于卡利霉素家族的有效載荷，在這種情況下，釋放是由兩步活化過程觸發(fā)的：第一步酸敏感腙被水解，第二步二硫鍵被GSH還原，使巰基中間體環(huán)化。這種連接子已經(jīng)在上市的Mylotarg和Besponsa中使用，但是它們?cè)谘獫{中的穩(wěn)定性不如預(yù)期，也不如其他可切割連接子吸引人。

3． 酶依賴性連接子

為了限制有效載荷在內(nèi)化前的釋放，從而防止或最小化目標(biāo)細(xì)胞外的降解，溶酶體的蛋白質(zhì)組分成為尋找能夠降解ADC并以高濃度存在的酶的合理場(chǎng)所。

組織蛋白酶－B

組織蛋白酶B是一種半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳動(dòng)物的晚期內(nèi)體和溶酶體中，在許多癌細(xì)胞中也過度表達(dá)。最初，一種可切割的二肽作為組織蛋白酶B的底物用作阿霉素前藥，這項(xiàng)工作建立了SAR的二肽部分：P1位置需要親水性殘基（瓜氨酸或精氨酸），而P2位置的親脂性殘基增強(qiáng)血漿穩(wěn)定性（苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸）。

此外，還引入了一個(gè)自降解間隔子來促進(jìn)酶的進(jìn)入，從而限制了有效載荷的空間位阻：對(duì)氨基芐基氨基甲酸酯（PABA）在酸性介質(zhì)中自發(fā)1，6－消除，釋放二氧化碳、對(duì)氮雜醌甲酰胺和阿霉素。最終，這一發(fā)現(xiàn)從前藥轉(zhuǎn)移到ADC領(lǐng)域，證明了Val－Cit和Phe－Lys二肽連接子的抗原驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞活性。

Val－Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解連接子，目前有多達(dá)25個(gè)分子處于臨床階段，可能是因?yàn)槠湔�體良好的血漿穩(wěn)定性、釋放行為和化學(xué)可牽引性。兩個(gè)已獲批的ADC藥物（Adcetris和Polivy） 都使用了相同的連接子mc－VC－PABC，其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標(biāo)準(zhǔn)Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子。

Val－Ala二肽也被廣泛應(yīng)用，有7個(gè)分子處于臨床階段，進(jìn)展最快的是Loncastuximab tesirine，其包括一個(gè)聚乙二醇化間隔子，以平衡屬于PBD二聚體家族的有效載荷SG3199的親脂性。

研究表明，由于沉淀和聚集，Val－Cit很難實(shí)現(xiàn)高DAR。相反，Val－Ala連接子允許DAR高達(dá)7．4，且聚集有限（＜10％）。與Val－Cit相比，Val－Ala的疏水性較低，這解釋了為什么這種連接子在親脂性的有效載荷（如PBD二聚體）方面表現(xiàn)卓越，7個(gè)臨床候選ADC的Val－Ala連接子都連接PBD。

一些研究將Val－Cit和Val－Ala二肽結(jié)構(gòu)與MMAE的有效載荷連接進(jìn)行了比較。在非內(nèi)化抗體的情況下，結(jié)合到工程化半胱氨酸的Val－Cit和Val－Ala連接子都表現(xiàn)出類似的特征，并且比Val－Lys和Val－Arg類似物表現(xiàn)出更好的性能。在使用隨機(jī)半胱氨酸結(jié)合的抗Her2 ADC的情況下，與Val－Cit相比，Val－Ala在高DAR結(jié)構(gòu)中顯示出較少的聚集性。另一方面，兩種連接子顯示出相似的緩沖穩(wěn)定性、組織蛋白酶B釋放效率、細(xì)胞活性和組織病理學(xué)特征。

四肽Gly－Gly－Phe－Gly顯示出穩(wěn)定和有效的可切割連接子的所有特性，已上市的ADC藥物Enhertu使用了此類連接子。第一三共的Enhertu是一種血漿穩(wěn)定的ADC，DAR為7．7，在溶酶體中發(fā)生蛋白酶降解，釋放DX－8951f，這是一種有效的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，來源于exatecan。由于連接子不含增溶劑，達(dá)到如此高的DAR是非�？捎^的，因?yàn)樗�與廣泛確立的原理相矛盾，即高DAR結(jié)合物可能具有較差的藥代動(dòng)力學(xué)特征。這里使用的自降解間隔子是簡(jiǎn)單和緊湊的半胺化，而不是Val－Cit連接子使用的PABC。

磷酸酶和焦磷酸酶

與組織蛋白酶一樣，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶體中選擇性表達(dá)的水解酶。2016年，默克公司的研究人員設(shè)計(jì)了含有磷酸和焦磷酸的連接子與組織蛋白酶B敏感的Val－Cit－PABA搭配，旨在傳遞糖皮質(zhì)激素：磷酸鹽／焦磷酸鹽部分結(jié)合在自降解間隔子PABA和有效載荷之間。內(nèi)化后，有效載荷可通過組織蛋白酶B、自降解間隔子和磷酸酶（n＝1）的順序釋放。對(duì)于焦磷酸酯（n＝2），可能需要另一個(gè)涉及焦磷酸酶的步驟。

這種親水性和永久性帶電基團(tuán)的優(yōu)點(diǎn)是溶解性，不僅能夠與親脂性糖皮質(zhì)激素衍生物進(jìn)行生物偶聯(lián)，而且促進(jìn)ADC純化， ADC中的殘余連接子少于0．10％。含有磷酸和焦磷酸的ADC在體外都具有活性。

默克公司的同一組研究人員還開發(fā)了一種獨(dú)特的基于焦磷酸酶的連接子，用于釋放含羥基有效載荷地塞米松和丙酸氟替卡松。

此外，羥基附著點(diǎn)的性質(zhì)對(duì)有效釋放至關(guān)重要。地塞米松的伯醇效果良好，而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一個(gè)縮醛間隔子，從而實(shí)現(xiàn)可接受的釋放。兩種ADC在體外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，對(duì)腫瘤細(xì)胞系具有較強(qiáng)的活性。

β－葡萄糖醛酸酶

β－葡萄糖醛酸酶是一類糖苷酶，催化β－葡萄糖醛酸殘基的水解，它在溶酶體和腫瘤間質(zhì)中高表達(dá)。西雅圖遺傳學(xué)的研究人員于2006年發(fā)表了一項(xiàng)開創(chuàng)性的工作，抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的連接子，葡萄糖醛酸附著在自降解間隔子上。這種連接子表現(xiàn)出低水平的聚集、高血漿穩(wěn)定性、以及強(qiáng)大的體內(nèi)功效。

該連接子還通過一個(gè)額外的二甲基乙二胺（DMED）自降解間隔子應(yīng)用于其他含胺的有效載荷，如喜樹堿類似物、SN38、杜卡霉素和苦參堿。釋放順序從水解β－葡萄糖醛酸到自降解間隔子，DMED的另一個(gè)環(huán)化反應(yīng)自發(fā)發(fā)生，形成1，3－二甲基咪唑啉－2－酮，并最終釋放含羥基藥物。由于連接子的親水性，與組織蛋白酶敏感連接子相比，該技術(shù)使ADC的DAR＝8制備更為容易。

β－半乳糖苷酶

最近報(bào)道了一種使用β－半乳糖苷酶裂解連接子的ADC，其中包含PEG10間隔子。間隔子被硝基取代，以提高自降解速率。類比β－葡萄糖醛酸酶連接子，其解離機(jī)制涉及水解β－半乳糖苷酶部分，它賦予化學(xué)前體親水性。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是β－半乳糖苷酶僅存在于溶酶體中，而β－葡萄糖醛酸酶在溶酶體中表達(dá)，也在實(shí)體瘤的微環(huán)境中表達(dá)。研究證明，在抗HER2－ADCs釋放MMAE的背景下，含β－半乳糖苷酶連接子的 ADC在體外和體內(nèi)均比T－DM1更為有效。

硫酸酯酶

最近，出現(xiàn)了硫酸酯酶裂解的連接子，硫酸酯酶在幾種癌癥類型中過度表達(dá)，表現(xiàn)出潛在的選擇性。研究涉及以MMAE為有效載荷的抗Her2抗體，與經(jīng)典的可切割Val－Cit和Val－Ala連接子相比，硫酸酯酶連接子對(duì)Her2＋細(xì)胞系顯示出相似的效力。