生物偶聯(lián)技術(shù)

1． 基于化學(xué)的特異性原位抗體修飾

單克隆抗體的天然結(jié)構(gòu)為生物偶聯(lián)提供了多種可能性，基于化學(xué)的、特異性的天然（非工程）抗體偶聯(lián)具有一些優(yōu)點。它可以避免抗體特定位點突變的復(fù)雜性，以及在細胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。

偶聯(lián)位點根據(jù)抗體序列，賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內(nèi)源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點非常具有吸引力。所有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ADC，直到2021年，都利用這些內(nèi)源性氨基酸進行偶聯(lián)。然而，抗體支架還包含聚糖，這是在單克隆抗體生產(chǎn)過程中，F(xiàn)C區(qū)域的翻譯后修飾所導(dǎo)致的。一些研究報告了糖工程化的新策略，這似乎是一種有趣的生物偶聯(lián)替代方法。

與內(nèi)源性氨基酸的偶聯(lián)

最常見的偶聯(lián)方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核NH2基團與利克有效載荷上親電的N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團發(fā)生反應(yīng)。盡管反應(yīng)簡單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導(dǎo)致了許多ADC在隨機分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物／抗體化學(xué)計量比的控制，該方法得到廣泛應(yīng)用，包括已獲批的ADC，如Besponsa， Mylotarg， 和Kadcyla。

最近，同樣也報道了對賴氨酸位點和殘基的特異性修飾。通過計算機輔助設(shè)計，磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑，用于在天然蛋白質(zhì)序列上對單個賴氨酸殘基進行修飾。

反應(yīng)的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設(shè)計以及每個賴氨酸周圍獨特的局部微環(huán)境。通過計算預(yù)測，pKa最低的賴氨酸容易以位點特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應(yīng)。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應(yīng)。該技術(shù)已應(yīng)用于5種不同的蛋白質(zhì)和曲妥珠單抗，在偶聯(lián)后均保留了原有的二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能。

2018年，Rai等人報告了另一種利用“化學(xué)關(guān)鍵蛋白”的可逆分子間反應(yīng)進行的位點特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團，這些官能團在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后，關(guān)鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應(yīng)。因此，在生理條件下，關(guān)鍵蛋白從賴氨酸中分離，醛被再生，從而能夠通過肟結(jié)合標(biāo)記抗體。

這種關(guān)鍵蛋白的定向修飾技術(shù)后來發(fā)展成單賴氨酸殘基標(biāo)記技術(shù)，即使在存在N－末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于Fk1－間隔子－Fk2試劑。

Fk1官能團與賴氨酸可逆反應(yīng)，調(diào)節(jié)Fk2近端賴氨酸部分的微環(huán)境。然后通過酰胺鍵在Fk2處的賴氨酸殘基（K169和K395）進行偶聯(lián)，間隔子的設(shè)計調(diào)節(jié)偶聯(lián)的位置。該方法已成功應(yīng)用于ADC（trastuzumab－emtansine）的合成，證明其細胞活性與已獲批準(zhǔn)的Kadcyla相當(dāng)。

Merlul等人最近報道了一種不同的結(jié)合策略，有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機金屬鉑（II）的連接子，［乙二胺鉑（II）］2＋，圖中表示為Lx。

這種技術(shù)基于絡(luò)合和偶聯(lián)兩個步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡(luò)合物前體，穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個氯離子。該復(fù)合物含有帶正電荷的Pt（II）中心，這提高了連接子和有效載荷復(fù)合物的水溶性并最小化抗體聚集，該方法還擴展到類似的碘絡(luò)合物。在最近的一份報告中，碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術(shù)的偶聯(lián)產(chǎn)率和選擇性。Cl－Lx－藥物載荷絡(luò)合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I－Lx－藥物載荷，從而獲得更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。這項技術(shù)已被應(yīng)用于ADC藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

二硫化物重橋接策略

IgG抗體包含四個鏈間二硫鍵，兩個連接輕鏈和重鏈，兩個位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū)，它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個經(jīng)典的生物偶聯(lián)途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點的作用。四個二硫鍵的還原通常會產(chǎn)生八個巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應(yīng)，從而產(chǎn)生DAR為8的ADC。

Doronina及其同事報告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯(lián)MMAE，DAR＝8的 ADC實例。與經(jīng)典的賴氨酸偶聯(lián)相比，這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而，據(jù)報道，較高的藥物負荷會增加聚集的風(fēng)險，從而導(dǎo)致高血漿清除率，并降低體內(nèi)療效。

Badescu和al在2014年報告了一種新的位點特異性重橋接偶聯(lián)策略，他們是第一個證明新的雙砜（bis－sulfone）能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個巰基，對抗原結(jié)合的影響最小。后來，Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應(yīng)活性。它表現(xiàn)出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點特異性。

此外，還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯(lián)的再橋接技術(shù)，其進一步發(fā)展出新一代馬來酰亞胺，如二溴－（DBM）和二硫代馬來酰亞胺（DTM），用于位點特異性偶聯(lián)。這些馬來酰亞胺類似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團，從而實現(xiàn)快速、高效和高產(chǎn)率的偶聯(lián)。最近報道了結(jié)合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質(zhì)的雜化硫代溴馬來酰亞胺（TBM），這種TBM試劑結(jié)合更快，顯示出更高的DAR＝4的百分比，這可能是由于溴減少了空間位阻。

2015年，Chudasama等人引入了一類新的重橋接試劑，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中，得到的結(jié)構(gòu)即使在高溫下也表現(xiàn)出了極好的水解穩(wěn)定性。然而，隨著還原步驟上的溫度升高，也觀察到不均一性，這種結(jié)構(gòu)也允許選擇性地引入不同的功能基團。

二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一種有效的重橋接試劑，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的DAR＝4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對半胱氨酸再橋接的作用，他們認(rèn)為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體，從而提高交聯(lián)效率。他們的工作擴展到二乙烯基三嗪，在高溫下，重橋接顯示出更高的效率。

為了避免與經(jīng)典馬來酰亞胺偶聯(lián)相關(guān)的體內(nèi)不穩(wěn)定性的缺點，Barbas等人研究了甲基磺�；�苯基惡二唑，該試劑對半胱氨酸具有特異性反應(yīng)。與血漿中的半胱氨酸－馬來酰亞胺偶聯(lián)物相比，他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā)，Zeglis設(shè)計了DiPODS試劑，該試劑含有兩個通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分， DiPODS以重橋接的方式與兩個硫酸根形成共價鍵。與馬來酰亞胺偶聯(lián)相比，以這種方式偶聯(lián)具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)性能。

聚糖偶聯(lián)

由于IgG是一種糖蛋白，它在Fc片段每個重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域N297位置包含一個N－聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點。多糖與Fab區(qū)域間遠距離定位降低了在偶聯(lián)后損害抗體的抗原結(jié)合能力的風(fēng)險，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學(xué)組成不同，允許位點特異性修飾，使它們成為合適的偶聯(lián)位點。

聚糖生物偶聯(lián)可根據(jù)用于靶向碳水化合物的技術(shù)來區(qū)分：包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉(zhuǎn)移酶處理、內(nèi)糖苷酶和轉(zhuǎn)移酶處理后的酮或疊氮化物標(biāo)記。

Neri等人報道了在IgG抗體的N－糖基化位點處巖藻糖的位點特異性修飾。這種糖含有一個順式二醇部分，適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基，生成一個能夠與含聯(lián)氨的連接子反應(yīng)的醛基，這樣，抗體通過腙鍵與藥物相連。

Senter及其同事向細胞培養(yǎng)基中添加硫基類似物，通過代謝將6－硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認(rèn)為，取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的，這樣就引入了化學(xué)位點來實現(xiàn)位點特異性結(jié)合。與經(jīng)典半胱氨酸偶聯(lián)物相比，這種方法顯著降低了異質(zhì)性水平，并產(chǎn)生具有更可預(yù)測的藥動學(xué)和藥效學(xué)特性的偶聯(lián)物。

重組IgG中很少含有唾液酸，然而，已經(jīng)證明，利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應(yīng)添加半乳糖以獲得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘酸氧化生成醛基，可以偶聯(lián)帶羥胺基團的連接子－有效載荷。所得的偶聯(lián)物具有較高的靶向選擇性，體內(nèi)抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影響與FcRn的結(jié)合。

除這些偶聯(lián)策略外，半乳糖殘基也可以作為修飾位點。多項研究報告了通過使用突變的β－ 1，4－半乳糖轉(zhuǎn)移酶，將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團的半乳糖，這種具有雙正交官能團的半乳糖衍生物為高效偶聯(lián)開辟了途徑。這些技術(shù)已被開發(fā)用于成像和抗癌應(yīng)用。

從化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N－聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯(lián)的有效位點。這種方法有助于使單抗的聚糖結(jié)構(gòu)均勻化，同時它也適用于任何IgG亞型。此類方法應(yīng)用于trastuzumab－maytansine，制備出具有良好體外和體內(nèi)藥效的糖偶聯(lián)ADC。

2． 工程化抗體的位點特異性生物偶聯(lián)

生物正交化學(xué)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進展有助于產(chǎn)生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇，但在工程化抗體上的位點特異性生物偶聯(lián)能夠更有效地控制DAR，并且避免改變與抗原結(jié)合的親和力。這樣，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有優(yōu)良藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特征的同質(zhì)產(chǎn)品。

酶法

有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標(biāo)簽以非常有選擇性的方式實現(xiàn)。這些標(biāo)簽被特定的酶所識別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG）、轉(zhuǎn)肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執(zhí)行位點特異性偶聯(lián)。

Aaron等人探索了一種新的利用醛標(biāo)記蛋白質(zhì)的位點特異性偶聯(lián)。該技術(shù)利用了基因編碼的五肽序列（Cys－X－Pro－X－Arg），其中半胱氨酸殘基被FGE識別，并在細胞中蛋白質(zhì)表達期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣，工程化抗體通過HIPS（hydrazino－Pictet–Spengler）化學(xué)方法與醛特異性連接子選擇性偶聯(lián)。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）策略也經(jīng)常被開發(fā)用于定位特異性偶聯(lián)。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側(cè)鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比，MTG是一種靈活的技術(shù)，不需要肽供體來實現(xiàn)偶聯(lián)。只要�；�受體含有一種伯胺，就沒有結(jié)構(gòu)限制。

谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺殘基通過MTGase介導(dǎo)的反應(yīng)偶聯(lián)，可以產(chǎn)生均一的DAR＝2的ADC。為了提高效率，可以偶聯(lián)帶支鏈的連接子，從而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。

NBE Therapeutics開發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的偶聯(lián)。他們的策略利用轉(zhuǎn)肽酶A（SrtA），在LPXTG（X＝任何氨基酸）五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后，它催化甘氨酸相關(guān)的有效載荷與新生成的C－末端的偶聯(lián)，在生理溫度和pH下生成肽鍵。

該方法應(yīng)用于不同抗體，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸標(biāo)記的連接子偶聯(lián)maytansine和MMAE，兩種ADC均顯示出與經(jīng)典偶聯(lián)相似的體外細胞殺傷活性。酶法產(chǎn)生的trastuzumab－maytansine在體內(nèi)試驗中完全匹配Kadcyla。

在另一個例子中，利用轉(zhuǎn)肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU－159682的ADC。有趣的是，通過這項技術(shù)，偶聯(lián)效率甚至高于Adcetris和Kadcyla類似物。此外，所制備的PNU－159682 ADC具有較高的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，并且顯示出的效力超過了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。

另一個新興的新方法是通過酪氨酸標(biāo)簽進行位點特異性抗體標(biāo)記，酪氨酸標(biāo)簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合。考慮到位點可及性，Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標(biāo)記，它為偶聯(lián)提供了一個容易觸及的位點。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1，2－醌，從而允許與各種雙環(huán)［6．1．0］壬炔（BCN）衍生物的環(huán)加成反應(yīng)。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯(lián)。

半胱氨酸工程：硫單抗技術(shù)

隨機半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。然而，隨機半胱氨酸方法的異質(zhì)性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在ADC合成中加以考慮，特別是當(dāng)疏水性藥物被偶聯(lián)時。

與它們不同的是，硫單抗技術(shù)通過利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應(yīng)性半胱氨酸，在抗體上實現(xiàn)所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設(shè)計是為了促進細胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時，保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術(shù)，包括計算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。

Junutula等人首先報道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC－A114），工程化位置內(nèi)的反應(yīng)性硫醇能夠與馬來酰亞胺負載的連接子反應(yīng)。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力，在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性，這個發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。

此外，琥珀酰亞胺連接在胞漿內(nèi)可以經(jīng)歷兩個平行反應(yīng)：反向Michael反應(yīng)導(dǎo)致連接子－有效載荷的損失，以及琥珀酰亞胺的水解，這兩種反應(yīng)都對體內(nèi)ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性，Lyon和合作者設(shè)計了一個與馬來酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進來的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸（DPR）促進了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解，這樣，非特異性的去偶聯(lián)作用被阻止，從而提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性。除了常用的馬來酰亞胺外，還探索了不同的半胱氨酸反應(yīng)劑，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N－烷基乙烯基吡啶鹽。

3． 與工程化非天然氨基酸的生物偶聯(lián)

除了硫單抗技術(shù)外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（ncAA）的加入為位點特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸，從而能夠以化學(xué)選擇性的方式引入連接子－有效載荷復(fù)合物。該技術(shù)需要對抗體序列重組，利用與宿主細胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應(yīng)未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常，ncAA在發(fā)酵過程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因為它們可能激發(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨特基團的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。

已有研究將對乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯(lián)，從而生成化學(xué)均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。

由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動力學(xué)，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應(yīng)用的對疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理條件下快速進行CuAAC或SPAAC反應(yīng)，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點特異性ADC。

此外，賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物（CypK）以及自然發(fā)生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。

ADC的相關(guān)內(nèi)吞途徑

一般來說，正常的內(nèi)吞作用可分為三個階段：（1）芽的形成，（2）膜的彎曲和囊泡的成熟，（3）膜的斷裂并釋放到細胞質(zhì)中。多種內(nèi)吞途徑有重疊的方面，因此內(nèi)吞的一般過程是高度靈活和復(fù)雜的。

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）在概念上是一個簡單的過程，包括幾個連續(xù)和部分重疊的步驟。CME可由質(zhì)膜上的某些受體結(jié)構(gòu)性啟動，或者需要配體和／或抗體結(jié)合后啟動。當(dāng)細胞質(zhì)中的內(nèi)吞衣殼蛋白開始聚集在質(zhì)膜的內(nèi)小葉上時，CME就開始了。衣殼蛋白通過從細胞質(zhì)中招募并與額外的蛋白質(zhì)適配器相互作用而繼續(xù)組裝和生長。關(guān)鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內(nèi)化受體／配體集中到一個“網(wǎng)格蛋白包被坑”（CCP）中。由于CCP內(nèi)陷增大，CCP頸縮窄時，通過一個斷裂過程與質(zhì)膜分離。肌動蛋白聚合有助于將CCP向內(nèi)拉入細胞質(zhì)，直到斷裂完成，CCP釋放并成為一個網(wǎng)格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV外殼被分解，CCV與內(nèi)涵體融合以運輸?shù)教囟ǖ膩喖毎�位置，或者可以被回收回細胞表面�? 

網(wǎng)格蛋白是CME的關(guān)鍵成分，由重鏈和輕鏈組成。三個網(wǎng)格蛋白重鏈和輕鏈形成一個三聚體，它與其他三聚體相互作用，并在新興的CCP周圍形成一個多邊形晶格。銜接蛋白2（AP－2）是一種異源四聚體復(fù)合物，它介導(dǎo)CCP頸部的收縮。Dynamin是一種GTP酶，在成熟囊泡的頸部形成螺旋狀聚合物。GTP水解后，dynamin誘導(dǎo)囊泡從質(zhì)膜分裂。

小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

不依賴于網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用包括小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白／GPI－富集的早期內(nèi)區(qū)室（CLIC／GEEC）和巨胞飲作用。

小窩是質(zhì)膜的小瓶狀內(nèi)陷，其特征是高水平的膽固醇和鞘糖脂，通過不依賴于網(wǎng)格蛋白的途徑介導(dǎo)內(nèi)吞作用，并且存在于大多數(shù)細胞類型中。小窩的主要支架蛋白是小窩蛋白，它是形成寡聚體的20–24 kDa完整膜蛋白。小窩蛋白共享共同的支架結(jié)構(gòu)域，這些支架結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與自身和其他包含小窩蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的相互作用。

雖然小窩具有類似CCPs的內(nèi)陷形態(tài)，但它們是不同的。簡單地說，CCP的密度是恒定的，而小窩的密度會因細胞類型的不同而變化很大。CCPs隨著萌發(fā)的內(nèi)體成熟而增大，相比之下，小窩囊泡保持不變的大小。一旦進入細胞內(nèi)，小窩就形成了高階結(jié)構(gòu)，而不是由CCPs形成的簡單的球形內(nèi)體。

小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的另一個獨特方面是，只有約1％的小窩是從質(zhì)膜上萌發(fā)的。在一小部分內(nèi)化的小窩中，它似乎遵循一條與Rab5（早期內(nèi)胚體的標(biāo)志物）共定位的循環(huán)途徑。這可能對以利用小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體為靶點的ADC帶來挑戰(zhàn)。

CLIC／GEEC內(nèi)吞作用

CLIC／GEEC是一種內(nèi)吞室，主要發(fā)生在配體激活的細胞中，這可能由生長因子、抗體的受體交聯(lián)或細菌毒素和病毒引起。此外，細胞膜必須處于高流動性狀態(tài)，因為CLIC／GEEC在低于生理溫度或膜處于更高張力的情況下不起作用。

CLIC在遷移細胞的前緣增加。識別CLIC／GEEC途徑的其他相關(guān)參數(shù)包括動力非依賴性質(zhì)膜斷裂、對膽固醇消耗的敏感性、Rab5／與早期內(nèi)體融合的獲得、胎盤堿性磷酸酶（PLAP）和與FAK相關(guān)的GTPase調(diào)節(jié)因子（GRAF1）。

巨胞飲作用

巨胞飲作用是一種更大規(guī)模的內(nèi)吞作用形式，通常涉及質(zhì)膜高度皺折的區(qū)域／突起，這些區(qū)域／突起隨后相互融合或與質(zhì)膜融合。膜皺褶是巨胞飲作用的形態(tài)學(xué)特征。

巨胞飲作用依賴于肌動蛋白聚合、Rac1蛋白和p21活化激酶1（PAK1）。PAK1是一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，因為它與Rac1相互作用，Rac1激活磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）、Ras、Src和Hsp90，以促進巨胞飲作用。巨胞飲作用也是膽固醇依賴性的，這是招募Rac1所必需的。這些成分最終導(dǎo)致比CME和小窩蛋白更大吸收面積的內(nèi)吞作用。

ADC靶向抗原的內(nèi)吞特性

CD33

CD33是一種67kda跨膜糖蛋白受體，通常在正常髓系細胞上表達，由于其在AML細胞上優(yōu)先過表達，是GO的靶點。CD33的胞內(nèi)免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）調(diào)節(jié)CD33的內(nèi)吞作用，可通過CME激活內(nèi)吞作用。關(guān)于內(nèi)吞效率，AML細胞中CD33的表達水平與其內(nèi)吞率之間沒有相關(guān)性。CD33是一種緩慢內(nèi)化的抗原，此外，CD33交聯(lián)并不能改善內(nèi)吞作用。對GO無響應(yīng)的AML患者可能與CD33受體內(nèi)吞的功能低下有關(guān)。

CD30

CD30是一種120kda跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。其細胞外部分由六個擴展構(gòu)象的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）組成。CD30在活化的T細胞和B細胞以及各種淋巴腫瘤（包括霍奇金淋巴瘤和ALCL）上表達。

CD30不具有內(nèi)吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脫落，CD30的脫落由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）介導(dǎo)。脫落是CD30生物學(xué)的一個特征，高濃度的循環(huán)可溶性CD30可以作為監(jiān)測腫瘤進展的血清標(biāo)志物。對于ADC的療效，升高的CD30循環(huán)水平似乎會隔離注射的ADC，從而減少能夠定位于CD30陽性腫瘤部位的ADC的數(shù)量。因此，缺乏內(nèi)吞作用的結(jié)果表明CD30不是理想的ADC靶點。

CD22

CD22是一種140 kDa的跨膜糖蛋白，與CD33一樣，它也是Siglec家族的成員，并與該家族共享多種結(jié)構(gòu)特征。關(guān)鍵的區(qū)別在于CD22比CD33大得多，因為它有多個Ig結(jié)構(gòu)域和ITIM／ITIM樣基序。CD22的表達僅限于B細胞，CD22在各種B細胞惡性腫瘤（包括ALL）的大多數(shù)母細胞中表達水平升高。

CD22通過CME進行內(nèi)吞作用。類天然配體通過CD22的結(jié)構(gòu)性快速內(nèi)吞在細胞內(nèi)積聚。這些配體在溶酶體中被分類降解，而CD22則循環(huán)回到細胞表面。此外，CD22配體誘導(dǎo)的內(nèi)吞激活細胞內(nèi)池，補充或增加細胞表面CD22的表達水平。因此，CD22對ADC具有良好的內(nèi)吞特性。

CD79b

CD79b僅在未成熟和成熟的B細胞中表達，在惡性腫瘤≥80％的B細胞中過表達。CD79a和CD79b是兩種非共價結(jié)合的跨膜蛋白，介導(dǎo)信號傳導(dǎo)和內(nèi)吞作用。對于后者，CD79a－CD79b異二聚體是控制BCR內(nèi)吞的支架。BCR內(nèi)吞作用主要由CME完成，并由AP－2介導(dǎo)。有趣的是，CD79a直接與AP－2的μ亞單位相互作用，進而激活CD79b并導(dǎo)致整個BCR復(fù)合物的內(nèi)吞。

此外，對于ADC來說，CD79a可以作為單體內(nèi)化，但CD79b卻不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸（Y195）發(fā)生突變，AP－2與CD79a的結(jié)合就會被阻斷，內(nèi)吞也被阻斷。在18％的活化B細胞樣DLBCL標(biāo)本中，Y195發(fā)生突變�？傊�，有證據(jù)表明CD79b其內(nèi)吞活性依賴于整個BCR復(fù)合體的內(nèi)化，而不是作為單體的內(nèi)化。

TROP－2

Trop2是一種46kDa的單體糖蛋白，具有選擇性過度表達、結(jié)構(gòu)性內(nèi)吞作用和導(dǎo)向溶酶體等特性，使其成為ADC的一個非常有吸引力的靶點。Trop2的內(nèi)化機制與CME有關(guān)。

觀察到的Trop2強大的內(nèi)吞作用，一種潛在的解釋可能是由于顯著的Trop2聚集。研究Trop2的構(gòu)象動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Trop2通過位于跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸“VVVVV”組成的相互作用片段形成天然的同型二聚體。Trop2的二聚作用可以通過其他細胞表面蛋白質(zhì)進一步將Trop2單體招募到更接近的位置。因此，Trop2簇很可能由多個二聚體通過脂筏和其他膜結(jié)合蛋白連接而成。

Trop2與多種配體結(jié)合，如claudin－1、claudin－7、cyclin D1和IGF1，然而，這些配體都沒有證明在與Trop2結(jié)合或相互作用時被內(nèi)化。因此，與正常細胞相比，Trop2在腫瘤細胞中發(fā)生的內(nèi)吞作用更為強烈，這些都表明Trop2是ADC的一個很好的靶點。

BCMA

BCMA或CD269，也稱為TNFR超家族成員17，轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)B細胞存活和增殖的信號。BCMA的分子量僅為20．2 kDa，其配體結(jié)合的胞外區(qū)域具有“臂椅”構(gòu)象，由六個CRD組成。除了多發(fā)性骨髓瘤外，BCMA還表達于許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

然而，關(guān)于BCMA所利用的精確內(nèi)吞途徑的知之甚少。與內(nèi)吞作用有關(guān)，唾液酸化是一種調(diào)節(jié)功能，它可能誘導(dǎo)BCMA利用CME發(fā)生內(nèi)吞作用。

HER2

HER2是一種185kda跨膜糖蛋白，屬于EGFR家族。HER2／neu基因的擴增是已知的人類惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移的驅(qū)動因素。由于HER2在癌癥中的作用，幾十年來一直被作為治療靶點。HER2也一直是ADCs的靶點，T－DM1和T－DXT都被批準(zhǔn)用于HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。

HER2的內(nèi)吞存在多種機制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的顯示HER2直接與AP－2結(jié)合，此外，dynasore能完全阻斷SKBR3細胞的HER2內(nèi)吞作用；其次小窩蛋白結(jié)合基序φxφxxxxφ（φ代表芳香族氨基酸Trp、Phe或Tyr）通常存在于小窩蛋白相關(guān)蛋白上，有趣的是，序列WSYGVTIW已在HER2的細胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域中被鑒定出；另外，有研究證明HER2可以利用CLIC／GEEC的內(nèi)吞途徑。

這些不同的發(fā)現(xiàn)揭示了HER2內(nèi)吞的重要特征。首先，HER2的內(nèi)吞作用是混雜的，其次，小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑似乎更常被利用。

Nectin－4

Nectin－4是一種66 kDa 的I型跨膜蛋白，其主要作用是促進細胞間的接觸。Nectin－4作為ADC靶點很有吸引力，因為研究表明，它在幾種腫瘤類型中過表達，但在正常成人組織中幾乎不存在。

目前，沒有發(fā)現(xiàn)天然配體或mAb／ADC與nectin－4的復(fù)合物內(nèi)吞的信息，但是可以借鑒nectin－4結(jié)合病原體內(nèi)吞的研究。Nectin－4也是麻疹病毒的受體，研究表明，麻疹病毒通過巨胞飲作用進入MCF7、HTB－20乳腺癌和DLD－1結(jié)直腸癌細胞。病毒進入需要PAK1，相反，dynamin抑制劑Dynasore對病毒進入沒有影響。此外，表達顯性負性小窩蛋白的細胞并不能消除病毒的內(nèi)吞作用。

基于這些間接研究，nectin－4表現(xiàn)出病毒受體所需的強大的內(nèi)吞活性。

ADC的藥代動力學(xué)

藥代動力學(xué)是臨床藥理學(xué)和現(xiàn)代藥物開發(fā)過程中不可缺少的一部分。應(yīng)該認(rèn)識到，與小分子和治療蛋白（抗體或融合蛋白）不同，ADC的PK非常復(fù)雜，因為ADC由幾個組成部分組成。不僅要考慮單抗的PK，還要考慮細胞毒性分子的PK以及結(jié)合的物化性質(zhì)。由于單抗的分子量占到了90％以上，因此ADC的不同組分的PK受其PK的影響很大。總抗（ADC＋mAb）的PK特征提供了ADC穩(wěn)定性和完整性的最佳評估。偶聯(lián)物和偶聯(lián)位點在維持ADCs的穩(wěn)定性和PK中也起著重要作用。下表列出了FDA批準(zhǔn)的ADC及其PK的特性。

一般來說，AD在給藥后，體內(nèi)涉及四個過程。這些過程是吸收、分布、代謝和清除。大多數(shù)抗體通常通過靜脈注射或輸液途徑給予，抗體也可以通過皮下（SC）途徑給予。然而，對于ADC，目前給藥途徑是靜脈注射或輸液。由于對細胞毒性有效載荷的反應(yīng)和細胞毒性物質(zhì)的局部沉積，SC給藥可能不適用于ADC。

藥物在體內(nèi)的分布可以用分布容積來描述。由于其大小和極性，抗體和ADC的分布通常局限于血管和間質(zhì)間隙。ADCs的初始分布一般局限于血管，其分布容積一般等于血容量。隨后，ADCs可以分布到間質(zhì)間隙。此外，ADC分布也會受到靶抗原表達和內(nèi)吞的影響。ADC在同一組織中的分布和積累會產(chǎn)生不良的（毒性）藥理學(xué)影響，這是由于ADC的攝取后的細胞毒性藥物或代謝物的釋放。

ADC體內(nèi)分解／代謝過程包括抗體分解代謝過程和小分子藥物體內(nèi)代謝。ADCs在到達腫瘤細胞前，在細胞內(nèi)（non－cleavable linker）或者循環(huán)系統(tǒng)中（cleavable linker）釋放效應(yīng)分子，未結(jié)合的抗體和抗體片段遵循抗體的代謝途徑通過酶解產(chǎn)生氨基酸，被機體重新利用。

ADC裂解或被分解代謝后可能形成的游離的小分子藥物和／或連有氨基酸殘基的小分子藥物和／或linker的小分子藥物代謝物，會進一步經(jīng)歷肝CYP450酶代謝，還可能發(fā)生潛在的藥物藥物相互作用。除了ADC本身性質(zhì)外，抗原的表達、受體／細胞密度，F(xiàn)cRn介導(dǎo)的循環(huán)作用、與Fcγ作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、免疫原性等都會影響ADC的分解代謝。

ADC也是通過分解代謝和排泄的方式進行消除。ADC可通過與靶點結(jié)合的特異途徑，進入溶酶體后發(fā)生降解，釋放小分子藥物后從體內(nèi)清除；還可以通過非特異的胞飲作用進行清除，該途徑涉及新生兒受體（FcRn）參與的循環(huán)再利用過程。

ADC、抗體、分子量較大的多肽及氨基酸片段無法通過腎小球濾過排泄，而是以氨基酸的形式重新吸收利用。游離小分子藥物、分子量較小的多肽及氨基酸連接的小分子藥物、分子量較小的抗體片段可通過腎小球濾過進行排泄。同時，小分子藥物及代謝產(chǎn)物也可經(jīng)酶代謝消除或通過轉(zhuǎn)運體排泄至糞便中。

ADC的免疫原性

在針對8個ADC的11個臨床試驗中， ADAs的基線發(fā)生率在1．4％到8．1％之間，基線后ADAs的發(fā)生率在0－35．8％之間，這些數(shù)值在治療性單克隆抗體的范圍內(nèi)�？偟膩碚f，ADCs的ADA發(fā)生率在靶向血液腫瘤的患者比靶向?qū)嶓w腫瘤的患者少；大多數(shù)ADA是針對ADC的單克隆抗體結(jié)構(gòu)域的。此外，在大多數(shù)患者中，這些ADC的半抗原樣結(jié)構(gòu)并不比治療性單克隆抗體產(chǎn)生更多的免疫應(yīng)答風(fēng)險。

ADC的臨床開發(fā)概況

目前，ADC藥物開發(fā)領(lǐng)域持續(xù)火熱，有效載荷，連接子和偶聯(lián)技術(shù)的快速發(fā)展使ADC具有更高的均勻性、穩(wěn)定性和生成效率。這為臨床上的ADC藥物開發(fā)提供了燃料，下面3個表格按照“小分子、生物大分子和放射性同位素”的分類總結(jié)了截至2021年2月處于臨床開發(fā)后期中的ADC。

小結(jié)

盡管第一個ADC在20多年前就獲得了FDA的首次批準(zhǔn)，但制藥行業(yè)必須經(jīng)歷一個漫長且乏味的學(xué)習(xí)過程，才能在市場和臨床開發(fā)中獲得一條穩(wěn)定的ADC管線。盡管目前已有13種已批準(zhǔn)的ADC，但是由于ADC的技術(shù)進步，該領(lǐng)域正在經(jīng)歷一次爆發(fā)，我們在有效載荷，連接子和偶聯(lián)技術(shù)方面獲得了多個突破，進一步加深了對ADC這種新型藥物的全面認(rèn)識。

此外，藥物劑量－暴露－效應(yīng)關(guān)系的確定是ADC成功的關(guān)鍵，內(nèi)吞作用是這種關(guān)系的關(guān)鍵部分，對于優(yōu)化給藥方案以最大限度地提高治療指數(shù)非常重要。然而盡管目前ADC領(lǐng)域如火如荼，但是我們對靶受體的內(nèi)吞作用仍知之甚少。另外，許多內(nèi)吞作用的核心成分和關(guān)鍵的效應(yīng)器非常重要，然而這些蛋白可能在癌癥中普遍發(fā)生突變，這也會影響ADC內(nèi)吞作用和療效。相信隨著該領(lǐng)域的發(fā)展，經(jīng)過無數(shù)次積累的經(jīng)驗，ADC終會迎來真正的春天。

參考文獻：

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals （Basel）． 2021 May； 14（5）： 442．

       原文標(biāo)題 : 通往ADC的成功之路：全面認(rèn)識ADC