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  文章背景簡(jiǎn)介  

BACKGROUND INTRODUCTION

PIK3CA（phosphoinositide－3－kinase，催化α多肽）基因突變是人類癌癥中最常發(fā)生突變的基因之一，已在乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等中發(fā)現(xiàn)。此外，PIK3CA突變與癌癥患者的較差生存率有關(guān)。在PIK3CA突變中，PIK3CA H1047R基因突變與癌癥的早期診斷、個(gè)體化治療和預(yù)后相關(guān)。因此，檢測(cè)具有高特異性和敏感性的PIK3CA H1047R基因突變?cè)诎┌Y篩查中具有重要意義。

通常，檢測(cè) PIK3CA 基因突變的常規(guī)方法包括DNA測(cè)序和基于 PCR 的方法。然而，臨床上可用的 DNA 測(cè)序只能在野生型 DNA的情況下檢測(cè)到0．1％～1％的突變DNA，這對(duì)其在臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)。例如，為了提高突變檢測(cè)的靈敏度，宋氏課題組提出肽核酸（PNA）介導(dǎo)的PCR特異性鑒別PIK3CA基因突變，靈敏度為0．2％。隨后，丁氏課題組采用等溫以同等靈敏度分析相同突變的擴(kuò)增策略。然而，這些方法實(shí)際上仍然難以檢測(cè)同質(zhì)樣品中的少量突變等位基因。在這種情況下，臨床診斷中的突變分析需要更高特異性和敏感性的策略。

近年來(lái)，針對(duì)突變位點(diǎn)的高保真識(shí)別提出了多種經(jīng)典策略，如表面連接反應(yīng)、錯(cuò)配結(jié)合蛋白介導(dǎo)策略、基于分子信標(biāo)的方法等。事實(shí)上，這些策略可以特異性地檢測(cè)突變區(qū)域以避免復(fù)雜的DNA測(cè)序，并由于其出色的突變識(shí)別能力而廣泛擴(kuò)展了基因診斷中的突變檢測(cè)。但是，這些方法存在一些固有的缺點(diǎn)，例如特異性差和靈敏度低。

作為識(shí)別基因突變的替代生物分子，NsbI限制酶作為位點(diǎn)特異性限制酶可以識(shí)別特定位點(diǎn)（5＇－TGA GCA） 并切割雙鏈 DNA。目前，NsbI限制性內(nèi)切酶在電化學(xué)生物傳感中用于PIK3CA基因突變檢測(cè)的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，鏈置換擴(kuò)增（SDA）反應(yīng)作為靶點(diǎn)循環(huán)擴(kuò)增的有效方法而廣為人知，通過(guò)該反應(yīng)可以有效地獲得DNA拷貝并放大生物信號(hào)。

另一方面，各種基于生物傳感的方法，如熒光、比色和電化學(xué)方法，已被用于檢測(cè)基因突變。在這些方法中，電化學(xué)策略因其靈敏度高、成本低、反應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)而在基因診斷領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。新興的納米器件已被引入電化學(xué)平臺(tái)以進(jìn)一步提高靈敏度，包括金屬納米顆粒、金屬有機(jī)框架 （MOF） 和獨(dú)特的 DNA納米結(jié)構(gòu)。到目前為止，由于具有放大電化學(xué)信號(hào)的能力，許多獨(dú)特的 DNA 納米結(jié)構(gòu)已被應(yīng)用于生物傳感器的設(shè)計(jì)。例如，Chen 和他的同事開(kāi)發(fā)了一種超靈敏的電化學(xué) DNA 生物傳感器，使用遠(yuǎn)程自組裝 DNA 納米結(jié)構(gòu)作為信號(hào)放大的載體。此外，朱的團(tuán)隊(duì)通過(guò)基于發(fā)夾組裝的生物傳感器檢測(cè)人類端粒酶RNA，將靈敏度提高到 17．0 fM。作為一類新型 DNA 納米結(jié)構(gòu)，通過(guò)簡(jiǎn)單制造工藝的四通 DNA 連接被選為開(kāi)發(fā)電化學(xué)生物傳感器的候選材料，通過(guò)這種方法可以捕獲更多的電活性分子，從而顯著增加電化學(xué)信號(hào)并提高生物傳感器的靈敏度。

生物傳感技術(shù)已被開(kāi)發(fā)用于基因突變，以滿足對(duì)良好重現(xiàn)性、短時(shí)間消耗和高靈敏度的持續(xù)要求。受上述啟發(fā)，通過(guò)將 NsbI－SDA 反應(yīng)與基于發(fā)夾的四向 DNA 連接相結(jié)合，研究人員開(kāi)發(fā)了一種電化學(xué)生物傳感器，可以超靈敏地檢測(cè) PIK3CA H1047R基因突變。通過(guò)這種策略，NsbI－SDA 不僅可以特異性區(qū)分 PIK3CA H1047R基因突變，還可以顯著增加DNA拷貝數(shù)，而新型四向 DNA 連接可以捕獲大量電活性亞甲藍(lán)（MB） 以增強(qiáng)電化學(xué)響應(yīng)。更重要的是，這種電化學(xué)生物傳感器可以檢測(cè)生物樣品中的低豐度基因突變，在基礎(chǔ)研究和臨床診斷方面都有潛在的應(yīng)用前景。

2020年，重慶醫(yī)科大學(xué)Tong Wang等在《Biosensors and Bioelectronics》（生物工程與應(yīng)用微生物1區(qū) IF＝11．213）發(fā)表了名為“An integrated electrochemical biosensor based on target－triggered strand displacement amplification and“four－way” DNA junction towards ultrasensitive detection of PIK3CA gene mutation”的研究論文。

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所用到的主要方法

METHODS  

1． 實(shí)驗(yàn)將 NsbI 限制性內(nèi)切酶與 SDA 相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種新的均相反應(yīng)策略，通過(guò)該策略識(shí)別 PIK3CA H1047R基因的突變位點(diǎn)并改善生物信號(hào)。

2．實(shí)驗(yàn)通過(guò)簡(jiǎn)單直接的自組裝過(guò)程制造了一種新型的四向 DNA 連接，以捕獲大量的電活性亞甲藍(lán) （MB） 以增強(qiáng)電化學(xué)響應(yīng)。

3．實(shí)驗(yàn)基于 NsbI 限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增 （NsbI－SDA） 和基于發(fā)夾的四向 DNA 連接的新型電化學(xué)傳感器可檢測(cè)低至0．001％的PIK3CA H1047R基因突變。

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

首次基于NsbI限制酶介導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增（NsbI－SDA）和四向DNA連接構(gòu)建了一種新型電化學(xué)生物傳感器，用于特異性和超靈敏檢測(cè)PIK3CA H1047R基因突變。在該生物傳感器中，NsbI限制性內(nèi)切酶結(jié)合鏈置換擴(kuò)增 （SDA） 能夠特異性區(qū)分 PIK3CA H1047R 基因突變和增加 DNA 拷貝數(shù)以改善電化學(xué)反應(yīng)。在目標(biāo)突變基因存在的情況下，由NsbI限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的DNA片段可以觸發(fā)SDA反應(yīng)，產(chǎn)生大量的連接鏈。當(dāng)連接器鏈被捕獲在電極上時(shí)，四向DNA接頭隨后連接到連接器鏈的末端。通過(guò)將亞甲藍(lán)（MB）的電活性分子整合到四向 DNA 連接中，這種三明治狀電化學(xué)生物傳感器能夠以0．001％的低檢出限確定目標(biāo)突變基因的特異性區(qū)別。最后，該策略可用于分析摻入人血清樣本中的突變基因，最后，表明該方法在遺傳分析和臨床疾病診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

       原文標(biāo)題 : 生物傳感器對(duì)PIK3CA基因突變的超靈敏檢測(cè)