前言

抗體偶聯(lián)藥物(ADC)是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細(xì)胞毒性藥物通過連接子鏈接而成,兼具傳統(tǒng)小分子化療的強(qiáng)大殺傷效應(yīng)及抗體藥物的腫瘤靶向性。ADC由三個(gè)主要部分組成：負(fù)責(zé)選擇性識(shí)別癌細(xì)胞表面抗原的抗體，負(fù)責(zé)殺死癌細(xì)胞的藥物有效載荷，以及連接抗體和有效載荷的連接子。

ADC對(duì)抗原的識(shí)別導(dǎo)致ADC通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過溶酶體降解后，有效載荷以生物活性形式釋放并發(fā)揮作用，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)有效載荷的數(shù)量由每個(gè)細(xì)胞表面抗原的數(shù)量、每個(gè)ADC的藥物有效載荷分子的數(shù)量（也稱為藥物抗體比率，DAR）以及抗原返回細(xì)胞表面所需的時(shí)間決定。有效載荷可能在癌細(xì)胞死亡和降解后逃逸，也可能從胞漿中透膜而出。這種釋放的后果可能是有益的（也稱為旁觀者效應(yīng)），也可能是有害的，導(dǎo)致全身毒性。

2009年gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg) 是美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的第一個(gè)ADC藥物。目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)上市了14個(gè)ADC藥物，還有上百個(gè)ADC藥物正處于臨床研究階段。   

2009年，卡利霉素、金盞花素和美登素類藥物是用于ADC開發(fā)的主要細(xì)胞毒素。十年來，這些分子仍然被用作有效載荷進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更好的穩(wěn)定性和親水性。新的細(xì)胞毒性物質(zhì)也被開發(fā)出來，如PBDs、杜卡霉素和喜樹堿衍生物等。

抗體工程在10年間也已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，允許更多的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)，提高了ADC的均一性和穩(wěn)定性。新的第二代和第三代ADC已經(jīng)進(jìn)入臨床，以期獲得更好的治療效果和安全性。幾十種基于半胱氨酸殘基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶聯(lián)技術(shù)也已經(jīng)在臨床前研究獲得了驗(yàn)證。此外，更多的腫瘤特異性抗原靶點(diǎn)和腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性藥物的釋放機(jī)制使ADC獲得了爆炸式的發(fā)展，ADC藥物進(jìn)入了黃金時(shí)代。

ADC的有效載荷

1. 微管破壞藥物

金盞花素

Auristatins是ADC中使用的重要有效載荷，最著名的家族成員MMAE存在于兩種上市藥物Adcetris和Polivy中。目前，超過10種以金盞花素（如MMAE）或一甲基金盞花素F（MMAF）為有效載荷的ADC正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

上圖描述了auristatine及其常用的連接位點(diǎn)。金盞花素的構(gòu)效關(guān)系（SAR）已被廣泛研究，主要集中在末端亞單位：P1（N-末端）和P5（C-末端），最常見的方法是在P1上引入氨基甲酸酯功能。

2015年，西雅圖遺傳學(xué)的研究人員將ADC有效載荷的范圍擴(kuò)大到包括叔胺，特別是N-二甲基auristatine，首次通過銨鍵將藥物與單克隆抗體結(jié)合。所得ADCs在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定，體內(nèi)外活性高，免疫特異性強(qiáng)。這些結(jié)果擴(kuò)大了ADC可用于靶向給藥的藥物種類。

最近，Agensys公司通過調(diào)節(jié)中心亞基P2-P3-P4，將疊氮化物基團(tuán)引入P2和P4亞基，在與蛋白酶可裂解的連接子偶聯(lián)后，產(chǎn)生了在體外和體內(nèi)效力提高的親水性衍生物，這為連接子的連接提供了新途徑。

一般來說，在同時(shí)含有胺和醇反應(yīng)的auristatin中，首選的連接點(diǎn)是胺通過氨基甲酸酯鍵偶聯(lián)。西雅圖遺傳學(xué)開發(fā)了一種新的策略，將含醇的有效載荷與亞甲基烷氧基氨基甲酸酯（MAC）偶聯(lián)。為了穩(wěn)定MAC鍵，堿性基團(tuán)和吸電子基團(tuán)都靠近氨基鍵，結(jié)果表明，該偶聯(lián)物在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的，具有很高的效價(jià)，并且在體內(nèi)外都具有免疫特異性。

此外，烏普薩拉大學(xué)的研究人員還開發(fā)了AZASTATIN，作為一類新的強(qiáng)有力的auristatin衍生物，包含一個(gè)中心胺側(cè)鏈的抗體結(jié)合位點(diǎn)。他們的研究結(jié)果證實(shí)，這些auristatin衍生物是一類新的細(xì)胞毒性有效載荷，適合ADC開發(fā)。

美登素衍生物（DM2，DM4）

美坦辛是一種非常有效的微管組裝抑制劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞的有絲分裂停止。但是這種結(jié)構(gòu)很難共軛，因?yàn)樗鼪]有反應(yīng)性官能團(tuán)，為了克服這個(gè)問題，一系列含有SMe基團(tuán)的非常有效的衍生物被創(chuàng)造出來。這一類分子的第一個(gè)例子是DM1和DM4，它們帶有甲硫丙�；�而不是天然N-乙酰基。

從有效載荷DM1和DM4中，通過使用二硫鍵與連接子偶聯(lián)。穩(wěn)定的二硫鍵連接子在血液循環(huán)中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)保持有效的分裂。

此外，幾種基于maytansine的ADC利用相同的二級(jí)羥基作為附著點(diǎn)，并在大多數(shù)情況下攜帶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生物結(jié)合的連接子。例如，一種基于Daratumumab的ADC被證明能向CD38過度表達(dá)的癌細(xì)胞特異性地傳遞DM4。最近ImmunoGen開發(fā)了一種新型的ADC，它包含一種含硫的maytansinoid，通過一種高度穩(wěn)定的三肽連接體連接到抗體上，附著點(diǎn)與上述羥基相同。與先前的美登素ADC相比，增加連接物中亞甲基單元的數(shù)量增加了旁觀者殺傷活性，并提高了小鼠體內(nèi)的療效。在類似的方法中，保持核心大環(huán)不變，Regeneron和Abzena的研究人員研究了N-甲基丙氨酸氮取代的影響，也改變了大環(huán)上側(cè)鏈的長(zhǎng)度，以及通過伯胺和仲胺連接的連接子。

微管溶素

Tubulysins是微管聚合的有效抑制劑，可導(dǎo)致分裂細(xì)胞的細(xì)胞骨架迅速解體，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它們是一個(gè)天然存在的四肽家族，含有Mep、Ile、Tuv和Tut，R3=OH或Tup，R3=H。

利用Tubulysins作為ADC有效載荷，其廣泛的附著點(diǎn)已被充分開發(fā)。這種結(jié)構(gòu)中一個(gè)明顯的附著點(diǎn)是Tut或Tup模塊的羧酸，如Endocyte的EC1428，其中羧酸通過酰肼部分連接到連接子。Oncomatryx公司也采用了同樣的方法，以同樣的方式安裝了可切割的PABAValCit馬來酰亞胺連接子。

阿斯利康、百時(shí)美施貴寶和輝瑞使用的另一種方法依賴于Tup或Tut中苯環(huán)的衍生化。

連接子與Mep基團(tuán)的連接也得到了廣泛的研究。Ingenica研究人員報(bào)告說，去甲基Mep類似物保留了強(qiáng)大的細(xì)胞毒性活性，可被視為有價(jià)值的有效載荷，允許在仲胺上引入不可切割的馬來酰亞胺己基連接子。

Oncomatryx的研究表明，當(dāng)Mep被另一個(gè)擁有仲胺的基序取代時(shí)，通過氨基甲酸酯鍵引入可切割的連接體是產(chǎn)生ADC的有效途徑。特別有趣的是，基因泰克關(guān)于通過季銨基團(tuán)將連接子連接到含叔胺的有效載荷上。在有效載荷上引入mc-Val-Cit-PABA連接子導(dǎo)致更多親水性結(jié)合物并改善了血液中的穩(wěn)定性。西雅圖遺傳學(xué)也采用了同樣的方法，通過過度表達(dá)葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸連接子也可以改善親水性和選擇性的細(xì)胞內(nèi)切割通過癌細(xì)胞中過表達(dá)的β-葡萄糖醛酸酶。

隱粘菌素

隱粘菌素（Cryptomycins，CR）是一個(gè)具有抗腫瘤活性的六元大環(huán)二肽家族。已有的臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明，在達(dá)到治療效果所需的劑量下，其毒性水平是不可接受的。

幾個(gè)小組嘗試將CR用于ADC，但是由于在CR中缺少偶聯(lián)位點(diǎn)，目前，有兩種不同的方法通過引入其它基團(tuán)，使得能夠連接ADC的連接子。一種是由基因泰克的研究人員將苯轉(zhuǎn)化為芐胺以產(chǎn)生有效的有效載荷，這種有效載荷適合通過氨基甲酸酯鍵連接。在第二種方法中，四川大學(xué)的研究人員利用了隱霉素-52的前藥形式（CR55），它可以在生理?xiàng)l件下重新環(huán)化為CR52。 

抗有絲分裂EG5抑制劑

紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白（KSP，也稱為Eg5或KIF11）是一種ATP依賴性運(yùn)動(dòng)蛋白，參與細(xì)胞周期中心體的分離。因此，用KSP抑制劑（KSPis）阻斷有絲分裂中的這一重要事件可產(chǎn)生抗腫瘤效力。

拜耳發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的吡咯亞類的KSPis，他們研究了該分子不同位置與保持對(duì)KSP強(qiáng)親和力的連接子的連接兼容性。

同樣，諾華的研究人員使用含咪唑的KSP抑制劑作為Eg5 ADC。利用伯醇或仲酰胺部分，他們安裝了帶有馬來酰亞胺端基的不可裂解連接子。當(dāng)與靶向HER2和c-KIT的抗體偶聯(lián)時(shí)，得到的ADC顯示出優(yōu)于Kadcyla的體內(nèi)療效。

2. DNA損傷藥物

吡咯苯并氮卓類和吲哚氯苯并氮卓類

吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮雜卓（PBD）是一類具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物。它們的作用方式是在DNA的小凹槽中進(jìn)行選擇性烷基化，其中鳥嘌呤的N2與PBD上的親電N10/C11亞胺形成共價(jià)鍵。

西雅圖遺傳學(xué)使用SGD1882的苯胺作為附著點(diǎn)，模仿可切割連接子中常用的PAB單元，釋放自由的PBD有效載荷。StemCentrx與Spirogen合作，利用PBD的N-10位置連接一個(gè)氨基甲酸酯的連接子。同樣的氨基甲酸酯鍵也被Immunogen用于結(jié)構(gòu)相似的吲哚氯苯偶氮卓二聚體（IBD）有效載荷。他們還報(bào)道了同一類IBD的不同方法，其中一個(gè)取代的苯環(huán)被用作兩個(gè)IBD單體的C8/C8'位置之間的連接物。

以類似的方法，Spirogen和Genentech設(shè)計(jì)了一種碘苯連接的PBD，允許在過渡金屬催化反應(yīng)中引入不同的連接子。通過使用Sonogashira偶聯(lián)、Buchwald–Hartwig偶聯(lián)或疊氮化物-炔烴點(diǎn)擊反應(yīng)，分別獲得炔烴、哌嗪或三唑連接的連接子有效載荷共軛物。

杜卡霉素

杜卡霉素是一種強(qiáng)大的細(xì)胞毒性物質(zhì)，通過其高活性的環(huán)丙烷環(huán)與DNA的小凹槽結(jié)合，并在N3位置烷基化腺嘌呤。非環(huán)化的，鹵甲基形式的杜卡霉素細(xì)胞毒性活性顯著降低。由于分子中苯酚基團(tuán)可作為內(nèi)消旋體激活劑，從而形成親電環(huán)丙烷，因此杜卡霉素ADC開發(fā)中的連接策略集中于酚官能團(tuán)的連接子連接。

在Synthon開發(fā)的SYD985中，苯酚基團(tuán)是通過雙氨基甲酸酯連接連接子與Mc-val-cit-PABC有效載荷的位置。組織蛋白酶B裂解后，游離苯酚促進(jìn)分子內(nèi)重排成親電環(huán)丙基形式。Medarex采用了一種不同的方法，通過分子非烷基化部分的芳香胺連接連接子，并用N-甲基哌嗪氨基甲酸酯部分掩蔽苯酚前藥。在體內(nèi)，苯酚將被釋放，隨后活性環(huán)丙烷將在羧酸酯酶的作用下形成。

喜樹堿

喜樹堿（CPT）及其衍生物是拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的經(jīng)典例子。它們穩(wěn)定了拓?fù)洚悩?gòu)酶誘導(dǎo)的DNA單鏈斷裂，當(dāng)三元DNA-TOP1-抑制劑復(fù)合物遇到復(fù)制叉時(shí)，DNA發(fā)生雙鏈斷裂。天然喜樹堿是一種五環(huán)結(jié)構(gòu)，其極低的溶解性阻止了其作為癌癥治療藥物的廣泛應(yīng)用。其水溶性前藥伊立替康獲得了轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的上市許可。SN-38是伊立新坦的活性代謝物，通過人體肝臟羧酸酯酶的作用在體內(nèi)生成，其可通過打開內(nèi)酯環(huán)而失活。

Immunomedics建立了兩種不同的策略，通過其羥基部分結(jié)合SN-38。在一個(gè)例子中，連接子通過反應(yīng)性更強(qiáng)的C-10苯酚基團(tuán)連接，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的氨基甲酸酯鍵，而在另一個(gè)例子中，通過C-20羥基，同時(shí)穩(wěn)定內(nèi)酯形式，而C-20羥基對(duì)體內(nèi)效力至關(guān)重要。

另一種適合ADC的非常有效的藥物是依沙替康（DDX-8951f）。這種喜樹堿類似物在其環(huán)己烷環(huán)上具有胺取代基，橋接7和9位。依沙替康的氨基有助于其水溶性，而環(huán)己烷環(huán)賦予的剛性被認(rèn)為有利于活性內(nèi)酯形式與非活性水解羥基酸的平衡。氨基羥基乙�；�生成DXd（1），而4-氨基丁�；�生成DXd（2），這兩種化合物都保留了依沙替康的生物活性。

懸垂的羥基和氨基是明顯的附著點(diǎn)，可使用酶可切割的Gly-Gly-Phe-Gly四肽連接子連接有效載荷。與抗HER2抗體偶聯(lián)產(chǎn)生的ADC在臨床環(huán)境中顯示出對(duì)抗HER2表達(dá)癌癥的巨大潛力。

DXd的環(huán)己胺環(huán)雖然被認(rèn)為穩(wěn)定了生物活性內(nèi)酯形式，但它攜帶了一個(gè)手性中心，使合成工作和SAR研究復(fù)雜化。為了克服這一困難，Immunogen的研究人員研究了一組新的喜樹堿類似物，這些類似物能夠與單抗偶聯(lián)。并且在這里，這個(gè)環(huán)被打開，額外的手性中心被消除。從一種常見的中間產(chǎn)物開始，研究人員嘗試了三種類型的結(jié)構(gòu)，并隨后使用不同的聚苯胺連接子連接有效載荷。當(dāng)與抗人表皮生長(zhǎng)因子受體（HuEGFR）的抗體偶聯(lián)時(shí)，產(chǎn)生的ADC對(duì)EGFR陽性的HSC-2腫瘤異種移植模型有效。

卡奇霉素

卡奇霉素是一類被廣泛研究的烯二炔類抗生素，其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制特別有趣和復(fù)雜，使其成為ADC有效載荷領(lǐng)域的一類抗生素。在ADC中連接calicheamicin的策略以市場(chǎng)上的adc Mylotarg為例，還有Besponsa。

有效載荷的釋放分兩步進(jìn)行：在酸性細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中對(duì)腙進(jìn)行敏感的裂解，然后通過細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原二硫鍵。釋放的硫醇發(fā)生分子內(nèi)1，4-加成的烯酮觸發(fā)伯格曼環(huán)化反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)二自由基。這種活性中間體能夠從脫氧核糖骨架中提取氫原子，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

最近，從不列顛哥倫比亞地衣中發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌中分離出一種新的烯二炔類天然產(chǎn)物，稱為uncialamycin。這種結(jié)構(gòu)通過全合成得到證實(shí)，從那時(shí)起，一些高效的合成類似物被制備成ADC的潛在有效載荷。

BMS的研究人員表明，由于在各種肽偶聯(lián)條件下反應(yīng)活性較低，因此，Uncialamycin的仲胺不是一個(gè)合適的連接點(diǎn)。研究人員合成了一種類似物，其中一個(gè)氨基直接引入到芳香環(huán)上，但這種苯胺的反應(yīng)性也太弱，不能作為連接子引入的基團(tuán)。另一方面，使用氨基乙基延伸物安裝脂肪族胺，為連接子提供了合適的連接點(diǎn)。

從后一個(gè)有效載荷中，他們使用蛋白酶可切割的二肽和不可切割的連接子制備前體。CD70-ADC具有可切割連接體，對(duì)腎癌細(xì)胞株具有高度特異性的細(xì)胞毒活性，而相應(yīng)的不可切割A(yù)DC在同一細(xì)胞株上不具有活性。

最近，為了繼續(xù)這項(xiàng)工作，BMS的研究人員在設(shè)計(jì)的、高效的、化學(xué)穩(wěn)定的uncialamycin類似物中使用苯酚基作為附著點(diǎn)。使用新開發(fā)的苯酚烷基化，在有效載荷的苯酚基團(tuán)上添加了一個(gè)經(jīng)典的可裂解連接子。將產(chǎn)生的有效載荷與抗體偶聯(lián)，其在體外和體內(nèi)均顯示抗原特異性抗腫瘤活性。

3. 創(chuàng)新藥物

凋亡誘導(dǎo)劑（Bcl-xL抑制劑）

抗凋亡Bcl-2家族成員（包括Bcl-xL）的過度表達(dá)是癌細(xì)胞獲得凋亡抵抗的機(jī)制之一。能夠阻斷Bcl-xL上BH3結(jié)合域的藥物可以觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL-xL抑制劑的有效載荷，其靶向表達(dá)EGFR的特定細(xì)胞或組織。有趣的是，研究人員在有效載荷上使用了三個(gè)不同的連接點(diǎn)來連接可切割的連接子。氨基烷基延伸的核心修飾用于在需要時(shí)建立合適的連接位點(diǎn)。

泰蘭司他丁及其類似物

靶向剪接體是一種參與mRNA加工的大型核糖核蛋白復(fù)合物，為靶向癌癥治療提供了一種有希望的治療選擇。有幾種天然產(chǎn)物能夠通過與不同的剪接體亞單位結(jié)合來抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以與剪接體的SF3b亞單位結(jié)合，從而阻止RNA剪接。

Thailanstatin A缺乏一個(gè)適合連接連接子的基團(tuán)。為了解決這個(gè)問題，將羧酸與乙二胺偶聯(lián)以引入含有胺的間隔基，該間隔基通常用于連接子的安裝。

將這種天然產(chǎn)物用于ADC的另一個(gè)困難是存在多種反應(yīng)性功能。例如，中心核中的二烯可以通過Diels–Alder反應(yīng)與用于生物結(jié)合的馬來酰亞胺部分反應(yīng)。這個(gè)問題是通過使用另一個(gè)共軛部分，鹵代乙酰胺來解決的。結(jié)合這兩種修飾并包含可切割連接子的ADC首次在專利文獻(xiàn)中報(bào)道，并且聲稱它們?cè)趲讉�(gè)表達(dá)HER2的細(xì)胞系中具有適度的活性。

最近，輝瑞報(bào)告說，羧酸直接與抗體的有效表面賴氨酸（無連接子偶聯(lián)）結(jié)合導(dǎo)致迄今為止最有效的Thailanstatin ADC。這些賴氨酸偶聯(lián)物的活性與藥物負(fù)載有關(guān)，而其他有效載荷類通常沒有觀察到這種特性。ADCs在胃癌異種移植模型中顯示出良好的作用。

鵝膏毒素 

在ADC技術(shù)領(lǐng)域，使用類似amatoxins的轉(zhuǎn)錄抑制劑是一種相對(duì)較新的方法。九種天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架結(jié)構(gòu)，一個(gè)由八個(gè)L-構(gòu)型氨基酸組成的大環(huán)，通過亞砜部分連接在色氨酸和半胱氨酸殘基之間。amatoxins的三個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)橇u基化的，OH基團(tuán)具有良好的水溶性并與目標(biāo)分子結(jié)合。兩種肽，α-鵝膏糖蛋白和β-鵝膏毒素，占所有毒素的90%。

在amatoxins上共使用過三個(gè)附著點(diǎn)產(chǎn)生ADC。第一次嘗試是將β-鵝膏毒素的羧基偶聯(lián)到IgG上賴氨酸的氨基，這種連接具有良好的血漿穩(wěn)定性和高細(xì)胞毒性，但這種生物偶聯(lián)的產(chǎn)率很低。二氫異亮氨酸的羥基也被認(rèn)為是一個(gè)連接點(diǎn)，引入谷胱甘肽作為連接子，然后通過賴氨酸結(jié)合，可獲得體外細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性優(yōu)異的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解連接子，導(dǎo)致其循環(huán)穩(wěn)定性差。第三種方法，附著于色氨酸的6-羥基代表了目前的標(biāo)準(zhǔn)程序，苯酚與各種連接子的醚化導(dǎo)致了高度穩(wěn)定和有效的ADC。由于鵝膏毒素其它氨基酸要么不具化學(xué)活性，要么是與RNA聚合酶II結(jié)合的關(guān)鍵，因此不能將其它的鵝膏毒素氨基酸（即羥脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和半胱氨酸）用于偶聯(lián)。

基于amanitin的代表性的ADC為HDP-101。有效載荷本身是一種合成的金剛烷醇衍生物，優(yōu)化了穩(wěn)定性。與天然天麻素相比，兩個(gè)差異是色氨酸中沒有6′-OH，硫醚鏈取代亞砜。通過天冬氨酸側(cè)鏈上酰胺的形成，引入組織蛋白酶B-裂解連接子。

最近，Park及其合作者為含苯酚的有效載荷設(shè)計(jì)了一種新的連接基序（OHPAS）。它是一種二芳基硫酸鹽，一個(gè)芳基部分來自有效載荷，另一個(gè)來自連接基序的潛在苯酚基團(tuán)。將該技術(shù)應(yīng)用于曲妥珠單抗ADC中的a-鵝膏毒素，在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性。

煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）是一種負(fù)責(zé)將煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酰胺單核苷酸的酶，其抑制劑在各種臨床前和臨床研究中顯示出有效性，但其臨床應(yīng)用受到靶向毒性和劑量限制性毒性的限制，如血小板減少和胃腸道不良反應(yīng)。

諾華公司的研究人員在NAMPT抑制劑有效載荷中的苯環(huán)對(duì)位中引入哌嗪部分，確定了合適的連接子附著點(diǎn)。這種分子在c-Kit和HER2表達(dá)細(xì)胞系上表現(xiàn)出納摩爾水平的效力，并且耐受性良好，在體內(nèi)表現(xiàn)出靶向依賴性。

卡馬霉素

從庫拉索菌中分離得到兩種新的蛋白酶抑制劑，卡馬霉素A和卡馬霉素B。兩者都具有亮氨酸衍生的α,β-環(huán)氧酮彈頭直接連接到甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜。他們被發(fā)現(xiàn)能抑制釀酒酵母20S蛋白酶β5亞單位活性（糜蛋白酶樣活性）。此外，它們對(duì)肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞株具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

然而，由于它們的高效價(jià)，它們的選擇性較差，經(jīng)常表現(xiàn)出毒副作用。因此，劇毒的卡馬霉素衍生物適合作為ADC的彈頭，可以保持所需的效力，并獲得更好的耐受性。所設(shè)計(jì)的類似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡馬霉素B），而不是卡馬霉素A中的亞砜甲硫氨酸，因?yàn)檫@消除了亞砜基立體異構(gòu)體混合物產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。 

第一代類似物在P4末端含有胺基，不幸的是，這個(gè)附著點(diǎn)并不合適，因?yàn)橛行лd荷顯示細(xì)胞毒性活性降低。第二代卡馬霉素類似物在P2側(cè)鏈上含有一個(gè)胺基，當(dāng)短乙基氨基鏈延伸磺酰基時(shí)，效果最好。在第三代類似物中，芳基連接砜和胺，因此降低了它的堿性。第二代和第三代有效載荷都顯示出強(qiáng)大的體外活性，并用可切割或不可切割的連接子連接。不幸的是，沒有一種ADC對(duì)受試癌細(xì)胞系表現(xiàn)出比曲妥珠單抗更高的細(xì)胞殺傷能力。

連接子

連接子不僅是抗體與小分子有效載荷之間形成共價(jià)連接的分子部分，而且是靶向藥物治療中具有設(shè)計(jì)性質(zhì)的關(guān)鍵元件。連接子的加入不應(yīng)誘導(dǎo)聚集，并且需要確保可接受的PK特性，同時(shí)限制有效載荷在血漿中的過早釋放（穩(wěn)定性），并使活性分子在靶向作用位點(diǎn)有效釋放。連接子分為兩類：不可切割型和可切割型。

1. 不可切割連接子

基于不可切割的連接子的ADC必須被內(nèi)化，抗體部分需要被溶酶體蛋白酶降解以釋放活性分子。在ADC開發(fā)過程中已經(jīng)探索了許多不可切割的連接子，最具代表性的是N-琥珀酰亞胺基-4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸鹽（SMCC），Kadcyla就是使用的此類型連接子。

這種結(jié)構(gòu)的分解代謝導(dǎo)致Lys-SMC-DM1成為主要的腫瘤代謝物。此外，與這種連接子相連的藥物通常不能發(fā)揮旁觀者效應(yīng)，因?yàn)獒尫诺姆纸獯�謝產(chǎn)物通透性較差。目前的研究主要集中在可切割的連接子上。

使用可切割連接子對(duì)于具內(nèi)化和不具內(nèi)化ADC的設(shè)計(jì)同樣可行，因?yàn)獒尫攀怯汕懈钗稽c(diǎn)（溶酶體和/或腫瘤環(huán)境）的性質(zhì)觸發(fā)的。連接子可以分為兩大類：酶依賴性和化學(xué)（即非酶）依賴性。

2. 化學(xué)依賴性連接子

含有二硫鍵的連接子受到硫醇的親核攻擊以釋放活性載荷。盡管血漿中人血清白蛋白（HSA）的還原形式就是最豐富的硫醇，但它對(duì)大分子的反應(yīng)性很差。胞漿中還含有高水平的谷胱甘肽（GSH），這是一種含有巰基的三肽，很容易與S-親核蛋白發(fā)生反應(yīng)。血液（微摩爾范圍）和細(xì)胞質(zhì)（毫摩爾范圍）中GSH濃度的差異以及癌細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激有助于藥物在癌細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先釋放。含有二硫鍵的連接子主要與maytansinoid類有效載荷相關(guān)。二硫鍵的反應(yīng)性可由空間位阻調(diào)節(jié)：α-甲基替換顯著影響還原速率和對(duì)硫醇-二硫鍵交換的抗性，如SAR-3419的連接子通過偕二甲基替換獲得SPDB-DM4最佳的抗腫瘤活性。

腙連接子顯示出依賴于pH的穩(wěn)定性，在中性pH下穩(wěn)定，并在酸性介質(zhì)中水解（內(nèi)體的pH<6，溶酶體的pH<5），形成相應(yīng)的酮和肼。

該方法已成功應(yīng)用于IMMU-110，包含一個(gè)可裂解�；�腙連接子，由4-馬來酰亞胺甲基環(huán)己烷-1-羧酸鹽（MCC）的酰肼與阿霉素中存在的酮基反應(yīng)中形成。

腙連接體也經(jīng)常用于卡利霉素家族的有效載荷，在這種情況下，釋放是由兩步活化過程觸發(fā)的：第一步酸敏感腙被水解，第二步二硫鍵被GSH還原，使巰基中間體環(huán)化。這種連接子已經(jīng)在上市的Mylotarg和Besponsa中使用，但是它們?cè)谘獫{中的穩(wěn)定性不如預(yù)期，也不如其他可切割連接子吸引人。

3. 酶依賴性連接子

為了限制有效載荷在內(nèi)化前的釋放，從而防止或最小化目標(biāo)細(xì)胞外的降解，溶酶體的蛋白質(zhì)組分成為尋找能夠降解ADC并以高濃度存在的酶的合理場(chǎng)所。 

組織蛋白酶-B

組織蛋白酶B是一種半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳動(dòng)物的晚期內(nèi)體和溶酶體中，在許多癌細(xì)胞中也過度表達(dá)。最初，一種可切割的二肽作為組織蛋白酶B的底物用作阿霉素前藥，這項(xiàng)工作建立了SAR的二肽部分：P1位置需要親水性殘基（瓜氨酸或精氨酸），而P2位置的親脂性殘基增強(qiáng)血漿穩(wěn)定性（苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸）。

此外，還引入了一個(gè)自降解間隔子來促進(jìn)酶的進(jìn)入，從而限制了有效載荷的空間位阻：對(duì)氨基芐基氨基甲酸酯（PABA）在酸性介質(zhì)中自發(fā)1,6-消除，釋放二氧化碳、對(duì)氮雜醌甲酰胺和阿霉素。最終，這一發(fā)現(xiàn)從前藥轉(zhuǎn)移到ADC領(lǐng)域，證明了Val-Cit和Phe-Lys二肽連接子的抗原驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞活性。

Val-Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解連接子，目前有多達(dá)25個(gè)分子處于臨床階段，可能是因?yàn)槠湔�體良好的血漿穩(wěn)定性、釋放行為和化學(xué)可牽引性。兩個(gè)已獲批的ADC藥物（Adcetris和Polivy) 都使用了相同的連接子mc-VC-PABC，其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標(biāo)準(zhǔn)Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子。

Val-Ala二肽也被廣泛應(yīng)用，有7個(gè)分子處于臨床階段，進(jìn)展最快的是Loncastuximab tesirine，其包括一個(gè)聚乙二醇化間隔子，以平衡屬于PBD二聚體家族的有效載荷SG3199的親脂性。

研究表明，由于沉淀和聚集，Val-Cit很難實(shí)現(xiàn)高DAR。相反，Val-Ala連接子允許DAR高達(dá)7.4，且聚集有限（<10%）。與Val-Cit相比，Val-Ala的疏水性較低，這解釋了為什么這種連接子在親脂性的有效載荷（如PBD二聚體）方面表現(xiàn)卓越，7個(gè)臨床候選ADC的Val-Ala連接子都連接PBD。

一些研究將Val-Cit和Val-Ala二肽結(jié)構(gòu)與MMAE的有效載荷連接進(jìn)行了比較。在非內(nèi)化抗體的情況下，結(jié)合到工程化半胱氨酸的Val-Cit和Val-Ala連接子都表現(xiàn)出類似的特征，并且比Val-Lys和Val-Arg類似物表現(xiàn)出更好的性能。在使用隨機(jī)半胱氨酸結(jié)合的抗Her2 ADC的情況下，與Val-Cit相比，Val-Ala在高DAR結(jié)構(gòu)中顯示出較少的聚集性。另一方面，兩種連接子顯示出相似的緩沖穩(wěn)定性、組織蛋白酶B釋放效率、細(xì)胞活性和組織病理學(xué)特征。

四肽Gly-Gly-Phe-Gly顯示出穩(wěn)定和有效的可切割連接子的所有特性，已上市的ADC藥物Enhertu使用了此類連接子。第一三共的Enhertu是一種血漿穩(wěn)定的ADC，DAR為7.7，在溶酶體中發(fā)生蛋白酶降解，釋放DX-8951f，這是一種有效的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，來源于exatecan。由于連接子不含增溶劑，達(dá)到如此高的DAR是非�？捎^的，因?yàn)樗�與廣泛確立的原理相矛盾，即高DAR結(jié)合物可能具有較差的藥代動(dòng)力學(xué)特征。這里使用的自降解間隔子是簡(jiǎn)單和緊湊的半胺化，而不是Val-Cit連接子使用的PABC。

磷酸酶和焦磷酸酶

與組織蛋白酶一樣，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶體中選擇性表達(dá)的水解酶。2016年，默克公司的研究人員設(shè)計(jì)了含有磷酸和焦磷酸的連接子與組織蛋白酶B敏感的Val-Cit-PABA搭配，旨在傳遞糖皮質(zhì)激素：磷酸鹽/焦磷酸鹽部分結(jié)合在自降解間隔子PABA和有效載荷之間。內(nèi)化后，有效載荷可通過組織蛋白酶B、自降解間隔子和磷酸酶（n=1）的順序釋放。對(duì)于焦磷酸酯（n=2），可能需要另一個(gè)涉及焦磷酸酶的步驟。

這種親水性和永久性帶電基團(tuán)的優(yōu)點(diǎn)是溶解性，不僅能夠與親脂性糖皮質(zhì)激素衍生物進(jìn)行生物偶聯(lián)，而且促進(jìn)ADC純化， ADC中的殘余連接子少于0.10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在體外都具有活性。

默克公司的同一組研究人員還開發(fā)了一種獨(dú)特的基于焦磷酸酶的連接子，用于釋放含羥基有效載荷地塞米松和丙酸氟替卡松。

此外，羥基附著點(diǎn)的性質(zhì)對(duì)有效釋放至關(guān)重要。地塞米松的伯醇效果良好，而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一個(gè)縮醛間隔子，從而實(shí)現(xiàn)可接受的釋放。兩種ADC在體外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，對(duì)腫瘤細(xì)胞系具有較強(qiáng)的活性。 

β-葡萄糖醛酸酶

β-葡萄糖醛酸酶是一類糖苷酶，催化β-葡萄糖醛酸殘基的水解，它在溶酶體和腫瘤間質(zhì)中高表達(dá)。西雅圖遺傳學(xué)的研究人員于2006年發(fā)表了一項(xiàng)開創(chuàng)性的工作，抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的連接子，葡萄糖醛酸附著在自降解間隔子上。這種連接子表現(xiàn)出低水平的聚集、高血漿穩(wěn)定性、以及強(qiáng)大的體內(nèi)功效。

該連接子還通過一個(gè)額外的二甲基乙二胺（DMED）自降解間隔子應(yīng)用于其他含胺的有效載荷，如喜樹堿類似物、SN38、杜卡霉素和苦參堿。釋放順序從水解β-葡萄糖醛酸到自降解間隔子，DMED的另一個(gè)環(huán)化反應(yīng)自發(fā)發(fā)生，形成1,3-二甲基咪唑啉-2-酮，并最終釋放含羥基藥物。由于連接子的親水性，與組織蛋白酶敏感連接子相比，該技術(shù)使ADC的DAR=8制備更為容易。

β-半乳糖苷酶

最近報(bào)道了一種使用β-半乳糖苷酶裂解連接子的ADC，其中包含PEG10間隔子。間隔子被硝基取代，以提高自降解速率。類比β-葡萄糖醛酸酶連接子，其解離機(jī)制涉及水解β-半乳糖苷酶部分，它賦予化學(xué)前體親水性。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是β-半乳糖苷酶僅存在于溶酶體中，而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶體中表達(dá)，也在實(shí)體瘤的微環(huán)境中表達(dá)。研究證明，在抗HER2-ADCs釋放MMAE的背景下，含β-半乳糖苷酶連接子的 ADC在體外和體內(nèi)均比T-DM1更為有效。

硫酸酯酶

最近，出現(xiàn)了硫酸酯酶裂解的連接子，硫酸酯酶在幾種癌癥類型中過度表達(dá)，表現(xiàn)出潛在的選擇性。研究涉及以MMAE為有效載荷的抗Her2抗體，與經(jīng)典的可切割Val-Cit和Val-Ala連接子相比，硫酸酯酶連接子對(duì)Her2+細(xì)胞系顯示出相似的效力。

生物偶聯(lián)技術(shù)

1. 基于化學(xué)的特異性原位抗體修飾

單克隆抗體的天然結(jié)構(gòu)為生物偶聯(lián)提供了多種可能性，基于化學(xué)的、特異性的天然（非工程）抗體偶聯(lián)具有一些優(yōu)點(diǎn)。它可以避免抗體特定位點(diǎn)突變的復(fù)雜性，以及在細(xì)胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。

偶聯(lián)位點(diǎn)根據(jù)抗體序列，賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內(nèi)源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點(diǎn)非常具有吸引力。所有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ADC，直到2021年，都利用這些內(nèi)源性氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)。然而，抗體支架還包含聚糖，這是在單克隆抗體生產(chǎn)過程中，F(xiàn)C區(qū)域的翻譯后修飾所導(dǎo)致的。一些研究報(bào)告了糖工程化的新策略，這似乎是一種有趣的生物偶聯(lián)替代方法。

與內(nèi)源性氨基酸的偶聯(lián)

最常見的偶聯(lián)方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核NH2基團(tuán)與利克有效載荷上親電的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。盡管反應(yīng)簡(jiǎn)單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導(dǎo)致了許多ADC在隨機(jī)分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物/抗體化學(xué)計(jì)量比的控制，該方法得到廣泛應(yīng)用，包括已獲批的ADC，如Besponsa, Mylotarg, 和Kadcyla。

最近，同樣也報(bào)道了對(duì)賴氨酸位點(diǎn)和殘基的特異性修飾。通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑，用于在天然蛋白質(zhì)序列上對(duì)單個(gè)賴氨酸殘基進(jìn)行修飾。

反應(yīng)的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設(shè)計(jì)以及每個(gè)賴氨酸周圍獨(dú)特的局部微環(huán)境。通過計(jì)算預(yù)測(cè)，pKa最低的賴氨酸容易以位點(diǎn)特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應(yīng)。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應(yīng)。該技術(shù)已應(yīng)用于5種不同的蛋白質(zhì)和曲妥珠單抗，在偶聯(lián)后均保留了原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能。

2018年，Rai等人報(bào)告了另一種利用“化學(xué)關(guān)鍵蛋白”的可逆分子間反應(yīng)進(jìn)行的位點(diǎn)特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團(tuán)，這些官能團(tuán)在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后，關(guān)鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應(yīng)。因此，在生理?xiàng)l件下，關(guān)鍵蛋白從賴氨酸中分離，醛被再生，從而能夠通過肟結(jié)合標(biāo)記抗體。

這種關(guān)鍵蛋白的定向修飾技術(shù)后來發(fā)展成單賴氨酸殘基標(biāo)記技術(shù)，即使在存在N-末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于Fk1-間隔子-Fk2試劑。

Fk1官能團(tuán)與賴氨酸可逆反應(yīng)，調(diào)節(jié)Fk2近端賴氨酸部分的微環(huán)境。然后通過酰胺鍵在Fk2處的賴氨酸殘基（K169和K395）進(jìn)行偶聯(lián)，間隔子的設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)偶聯(lián)的位置。該方法已成功應(yīng)用于ADC（trastuzumab-emtansine）的合成，證明其細(xì)胞活性與已獲批準(zhǔn)的Kadcyla相當(dāng)。 

Merlul等人最近報(bào)道了一種不同的結(jié)合策略，有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機(jī)金屬鉑（II）的連接子，[乙二胺鉑（II）]2+，圖中表示為L(zhǎng)x。

這種技術(shù)基于絡(luò)合和偶聯(lián)兩個(gè)步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡(luò)合物前體，穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個(gè)氯離子。該復(fù)合物含有帶正電荷的Pt（II）中心，這提高了連接子和有效載荷復(fù)合物的水溶性并最小化抗體聚集，該方法還擴(kuò)展到類似的碘絡(luò)合物。在最近的一份報(bào)告中，碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術(shù)的偶聯(lián)產(chǎn)率和選擇性。Cl-Lx-藥物載荷絡(luò)合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I-Lx-藥物載荷，從而獲得更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。這項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于ADC藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

二硫化物重橋接策略

IgG抗體包含四個(gè)鏈間二硫鍵，兩個(gè)連接輕鏈和重鏈，兩個(gè)位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū)，它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個(gè)經(jīng)典的生物偶聯(lián)途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點(diǎn)的作用。四個(gè)二硫鍵的還原通常會(huì)產(chǎn)生八個(gè)巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應(yīng)，從而產(chǎn)生DAR為8的ADC。

Doronina及其同事報(bào)告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯(lián)MMAE，DAR=8的 ADC實(shí)例。與經(jīng)典的賴氨酸偶聯(lián)相比，這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而，據(jù)報(bào)道，較高的藥物負(fù)荷會(huì)增加聚集的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致高血漿清除率，并降低體內(nèi)療效。

Badescu和al在2014年報(bào)告了一種新的位點(diǎn)特異性重橋接偶聯(lián)策略，他們是第一個(gè)證明新的雙砜（bis-sulfone）能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個(gè)巰基，對(duì)抗原結(jié)合的影響最小。后來，Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應(yīng)活性。它表現(xiàn)出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點(diǎn)特異性。

此外，還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯(lián)的再橋接技術(shù)，其進(jìn)一步發(fā)展出新一代馬來酰亞胺，如二溴-（DBM）和二硫代馬來酰亞胺（DTM），用于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。這些馬來酰亞胺類似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)快速、高效和高產(chǎn)率的偶聯(lián)。最近報(bào)道了結(jié)合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質(zhì)的雜化硫代溴馬來酰亞胺（TBM），這種TBM試劑結(jié)合更快，顯示出更高的DAR=4的百分比，這可能是由于溴減少了空間位阻。

2015年，Chudasama等人引入了一類新的重橋接試劑，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中，得到的結(jié)構(gòu)即使在高溫下也表現(xiàn)出了極好的水解穩(wěn)定性。然而，隨著還原步驟上的溫度升高，也觀察到不均一性，這種結(jié)構(gòu)也允許選擇性地引入不同的功能基團(tuán)。

二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一種有效的重橋接試劑，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的DAR=4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對(duì)半胱氨酸再橋接的作用，他們認(rèn)為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體，從而提高交聯(lián)效率。他們的工作擴(kuò)展到二乙烯基三嗪，在高溫下，重橋接顯示出更高的效率。

為了避免與經(jīng)典馬來酰亞胺偶聯(lián)相關(guān)的體內(nèi)不穩(wěn)定性的缺點(diǎn)，Barbas等人研究了甲基磺�；�苯基惡二唑，該試劑對(duì)半胱氨酸具有特異性反應(yīng)。與血漿中的半胱氨酸-馬來酰亞胺偶聯(lián)物相比，他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā)，Zeglis設(shè)計(jì)了DiPODS試劑，該試劑含有兩個(gè)通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分， DiPODS以重橋接的方式與兩個(gè)硫酸根形成共價(jià)鍵。與馬來酰亞胺偶聯(lián)相比，以這種方式偶聯(lián)具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)性能。

聚糖偶聯(lián)

由于IgG是一種糖蛋白，它在Fc片段每個(gè)重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域N297位置包含一個(gè)N-聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點(diǎn)。多糖與Fab區(qū)域間遠(yuǎn)距離定位降低了在偶聯(lián)后損害抗體的抗原結(jié)合能力的風(fēng)險(xiǎn)，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學(xué)組成不同，允許位點(diǎn)特異性修飾，使它們成為合適的偶聯(lián)位點(diǎn)。

聚糖生物偶聯(lián)可根據(jù)用于靶向碳水化合物的技術(shù)來區(qū)分：包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉(zhuǎn)移酶處理、內(nèi)糖苷酶和轉(zhuǎn)移酶處理后的酮或疊氮化物標(biāo)記。

Neri等人報(bào)道了在IgG抗體的N-糖基化位點(diǎn)處巖藻糖的位點(diǎn)特異性修飾。這種糖含有一個(gè)順式二醇部分，適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基，生成一個(gè)能夠與含聯(lián)氨的連接子反應(yīng)的醛基，這樣，抗體通過腙鍵與藥物相連。

Senter及其同事向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加硫基類似物，通過代謝將6-硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認(rèn)為，取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的，這樣就引入了化學(xué)位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性結(jié)合。與經(jīng)典半胱氨酸偶聯(lián)物相比，這種方法顯著降低了異質(zhì)性水平，并產(chǎn)生具有更可預(yù)測(cè)的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特性的偶聯(lián)物。

重組IgG中很少含有唾液酸，然而，已經(jīng)證明，利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應(yīng)添加半乳糖以獲得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘酸氧化生成醛基，可以偶聯(lián)帶羥胺基團(tuán)的連接子-有效載荷。所得的偶聯(lián)物具有較高的靶向選擇性，體內(nèi)抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影響與FcRn的結(jié)合。

除這些偶聯(lián)策略外，半乳糖殘基也可以作為修飾位點(diǎn)。多項(xiàng)研究報(bào)告了通過使用突變的β- 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團(tuán)的半乳糖，這種具有雙正交官能團(tuán)的半乳糖衍生物為高效偶聯(lián)開辟了途徑。這些技術(shù)已被開發(fā)用于成像和抗癌應(yīng)用。

從化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N-聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯(lián)的有效位點(diǎn)。這種方法有助于使單抗的聚糖結(jié)構(gòu)均勻化，同時(shí)它也適用于任何IgG亞型。此類方法應(yīng)用于trastuzumab-maytansine，制備出具有良好體外和體內(nèi)藥效的糖偶聯(lián)ADC。

2. 工程化抗體的位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)

生物正交化學(xué)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進(jìn)展有助于產(chǎn)生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇，但在工程化抗體上的位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)能夠更有效地控制DAR，并且避免改變與抗原結(jié)合的親和力。這樣，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有優(yōu)良藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征的同質(zhì)產(chǎn)品。

酶法

有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標(biāo)簽以非常有選擇性的方式實(shí)現(xiàn)。這些標(biāo)簽被特定的酶所識(shí)別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG）、轉(zhuǎn)肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執(zhí)行位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。

Aaron等人探索了一種新的利用醛標(biāo)記蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。該技術(shù)利用了基因編碼的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸殘基被FGE識(shí)別，并在細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣，工程化抗體通過HIPS（hydrazino-Pictet–Spengler）化學(xué)方法與醛特異性連接子選擇性偶聯(lián)。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）策略也經(jīng)常被開發(fā)用于定位特異性偶聯(lián)。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側(cè)鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比，MTG是一種靈活的技術(shù)，不需要肽供體來實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。只要酰基受體含有一種伯胺，就沒有結(jié)構(gòu)限制。

谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個(gè)重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺殘基通過MTGase介導(dǎo)的反應(yīng)偶聯(lián)，可以產(chǎn)生均一的DAR=2的ADC。為了提高效率，可以偶聯(lián)帶支鏈的連接子，從而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。

NBE Therapeutics開發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的偶聯(lián)。他們的策略利用轉(zhuǎn)肽酶A（SrtA），在LPXTG（X=任何氨基酸）五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后，它催化甘氨酸相關(guān)的有效載荷與新生成的C-末端的偶聯(lián)，在生理溫度和pH下生成肽鍵。

該方法應(yīng)用于不同抗體，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸標(biāo)記的連接子偶聯(lián)maytansine和MMAE，兩種ADC均顯示出與經(jīng)典偶聯(lián)相似的體外細(xì)胞殺傷活性。酶法產(chǎn)生的trastuzumab-maytansine在體內(nèi)試驗(yàn)中完全匹配Kadcyla。

在另一個(gè)例子中，利用轉(zhuǎn)肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU-159682的ADC。有趣的是，通過這項(xiàng)技術(shù)，偶聯(lián)效率甚至高于Adcetris和Kadcyla類似物。此外，所制備的PNU-159682 ADC具有較高的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，并且顯示出的效力超過了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。

另一個(gè)新興的新方法是通過酪氨酸標(biāo)簽進(jìn)行位點(diǎn)特異性抗體標(biāo)記，酪氨酸標(biāo)簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合�？紤]到位點(diǎn)可及性，Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標(biāo)記，它為偶聯(lián)提供了一個(gè)容易觸及的位點(diǎn)。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1,2-醌，從而允許與各種雙環(huán)[6.1.0]壬炔（BCN）衍生物的環(huán)加成反應(yīng)。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯(lián)。

半胱氨酸工程：硫單抗技術(shù)

隨機(jī)半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。然而，隨機(jī)半胱氨酸方法的異質(zhì)性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在ADC合成中加以考慮，特別是當(dāng)疏水性藥物被偶聯(lián)時(shí)。

與它們不同的是，硫單抗技術(shù)通過利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應(yīng)性半胱氨酸，在抗體上實(shí)現(xiàn)所需位點(diǎn)的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設(shè)計(jì)是為了促進(jìn)細(xì)胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時(shí)，保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術(shù)，包括計(jì)算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。

Junutula等人首先報(bào)道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC-A114），工程化位置內(nèi)的反應(yīng)性硫醇能夠與馬來酰亞胺負(fù)載的連接子反應(yīng)。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力，在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性，這個(gè)發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。

此外，琥珀酰亞胺連接在胞漿內(nèi)可以經(jīng)歷兩個(gè)平行反應(yīng)：反向Michael反應(yīng)導(dǎo)致連接子-有效載荷的損失，以及琥珀酰亞胺的水解，這兩種反應(yīng)都對(duì)體內(nèi)ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性，Lyon和合作者設(shè)計(jì)了一個(gè)與馬來酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進(jìn)來的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸（DPR）促進(jìn)了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解，這樣，非特異性的去偶聯(lián)作用被阻止，從而提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性。除了常用的馬來酰亞胺外，還探索了不同的半胱氨酸反應(yīng)劑，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N-烷基乙烯基吡啶鹽。

3. 與工程化非天然氨基酸的生物偶聯(lián)

除了硫單抗技術(shù)外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（ncAA）的加入為位點(diǎn)特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸，從而能夠以化學(xué)選擇性的方式引入連接子-有效載荷復(fù)合物。該技術(shù)需要對(duì)抗體序列重組，利用與宿主細(xì)胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應(yīng)未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常，ncAA在發(fā)酵過程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因?yàn)樗鼈兛赡芗ぐl(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨(dú)特基團(tuán)的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。

已有研究將對(duì)乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯(lián)，從而生成化學(xué)均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。

由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動(dòng)力學(xué)，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應(yīng)用的對(duì)疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理?xiàng)l件下快速進(jìn)行CuAAC或SPAAC反應(yīng)，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點(diǎn)特異性ADC。

此外，賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物（CypK）以及自然發(fā)生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進(jìn)入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。

ADC的進(jìn)化史

Mylotarg、Besponsa和第一代可切割連接子

Mylotarg于2000年被FDA批準(zhǔn)用于治療急性髓細(xì)胞白血�。ˋML）。它是由卡奇霉素通過一個(gè)包含腙鍵的可切割連接子與gemtuzumab（一種突變的抗CD33 IgG4亞型單抗）偶聯(lián)而成。這種ADC的平均藥物抗體比(DAR)只有1.5，含有約50%的未偶聯(lián)單克隆抗體。ADC內(nèi)化后，腙鍵可在內(nèi)體酸性環(huán)境中水解，釋放出卡奇霉素的前體，然后由谷胱甘肽還原為自由活性的卡奇霉素。后者與DNA小凹槽結(jié)合并經(jīng)歷Bergman環(huán)化，從而產(chǎn)生高度反應(yīng)性的雙自由基，引起序列選擇性DNA雙鏈切割。

從理論上講，腙在生理pH值下應(yīng)在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，并在酸性條件下內(nèi)化后進(jìn)行選擇性水解。然而，Mylotarg的連接子表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致卡奇霉素在血漿循環(huán)中過早釋放，嚴(yán)重的毒性導(dǎo)致隨后輝瑞公司在2010年將Mylotarg退市。

得益于近年來在臨床上積累的經(jīng)驗(yàn)以及技術(shù)的進(jìn)步，Mylotarg于2017年重新獲批，優(yōu)化后提高了連接子的穩(wěn)定性，以較低劑量使用，并修改給藥計(jì)劃，適用于不同的患者群體。

一個(gè)類似的連接子被開發(fā)出來并用于將卡奇霉素偶聯(lián)到inotuzumab，一種突變的CD22靶向抗體上， inotuzumab-ozogamicin (Besponsa）于2017年被FDA批準(zhǔn)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血�。ˋLL）。

Kadcyla和第二代不可切割連接子

鑒于這些發(fā)現(xiàn)，人們繼續(xù)開發(fā)連接子設(shè)計(jì)的替代策略。然而，一個(gè)偶然的發(fā)現(xiàn)使Immunogen得以識(shí)別出一種出人意料的有效ADC。DM1通過含有N-琥珀酰亞胺基-4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸鹽（SMCC）的不可切割的連接子與曲妥珠單抗的賴氨酸殘基偶聯(lián)，這種ADC（T-DM1，Kadcyla）于2013年經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于HER2陽性乳腺癌患者。

這種新型的ADC在HER2陽性乳腺癌模型中非常有效，只有ADC在內(nèi)化后在溶酶體中經(jīng)酶完全消化后，原始結(jié)構(gòu)才具有活性，以獲得活性代謝物L(fēng)ys-MCC-DM1。

Adcetris, Polivy和第二代可切割連接子

與此同時(shí)，西雅圖遺傳學(xué)設(shè)計(jì)了自己的偶聯(lián)技術(shù)，通過可切割連接子mc-VC-PABC，其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標(biāo)準(zhǔn)Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子，將金盞花素（MMAE）生物偶聯(lián)到抗CD30 抗體的半胱氨酸殘基上，這種ADC（Adcetris）于 2011年被FDA批準(zhǔn)用于間變性大細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的治療。

Adcetris在腫瘤細(xì)胞內(nèi)化后，可切割連接子降解，釋放出的MMAE能破壞靶細(xì)胞并擴(kuò)散到細(xì)胞膜上，到達(dá)并殺死鄰近的癌細(xì)胞。這種現(xiàn)象被稱為旁觀者效應(yīng)，允許釋放的MMAE殺死CD30陽性和CD30陰性的腫瘤細(xì)胞。

類似地，這種第二代連接子（mc-VC-PABC）被用于Polivy，一種將MMAE與polatuzumab（抗CD79b單抗）偶聯(lián)的ADC，于2019年6月被FDA批準(zhǔn)用于治療成人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）。

第三代位點(diǎn)特異性的ADC

盡管ADC取得了越來越大的成功，但直到2019年，市場(chǎng)上每一個(gè)批準(zhǔn)的ADC都是以異質(zhì)混合物的形式存在的，單抗上的細(xì)胞毒性藥物數(shù)量不同且分布在不同的地方，導(dǎo)致了生產(chǎn)過程中的分析問題。事實(shí)上，DAR是不受控制的，這種復(fù)雜的混合物會(huì)顯著影響ADC的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效。

裸抗體可能是一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，弱DAR偶聯(lián)物的療效較差，而具有高DAR的抗體在血漿中會(huì)被迅速消除，從而損害了ADC的治療窗口。為了拓寬ADCs的治療指數(shù)，自2008年以來，區(qū)域特異性生物結(jié)合方法得到廣泛發(fā)展。這些位點(diǎn)特異性方法可分為三類：（i）天然或非天然氨基酸的生物偶聯(lián)，（ii）使用酶的生物偶聯(lián)或（iii）基于連接物的生物偶聯(lián)。

第一種方法是通過抗體工程引入特定的氨基酸。Junutula和他在Genentech的同事是先驅(qū)者，他們通過在靶向卵巢癌抗原MUC16的單克隆抗體的265位氨基酸與Adcetris®連接子進(jìn)行定點(diǎn)生物偶聯(lián)，開發(fā)出一種ADC。為此，他們?cè)趩慰寺】贵w的氨基酸序列中引入了兩種半胱氨酸，選擇了這兩種半胱氨酸來保持IgG折疊和與抗原結(jié)合。

將得到的TDC（ADC-硫單抗）與使用傳統(tǒng)隨機(jī)生物結(jié)合方法生成的ADC進(jìn)行比較。

兩種ADC在小鼠異種移植模型中均有效，但TDC在大鼠和食蟹猴體內(nèi)的耐受性高于ADC，并且在體內(nèi)表現(xiàn)出較低的全身毒性。受此策略的啟發(fā)，Seattle Genetics和Spirogen開發(fā)了一種類似的技術(shù)，稱為MAIA，通過在mAb關(guān)鍵區(qū)域的239位引入絲氨酸半胱氨酸突變，實(shí)現(xiàn)PBD二聚體的生物偶聯(lián)。

第二種可能性是使用酶介導(dǎo)的區(qū)域特異性生物結(jié)合技術(shù)。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶催化天然單抗的谷氨酰胺側(cè)鏈與含有伯胺的分子之間形成酰胺鍵�；�于此，Innate Pharma已經(jīng)開發(fā)了一種使用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶構(gòu)建ADC的三步方法，如下圖所示。

最后，區(qū)域特異性ADC也可以從天然單抗中產(chǎn)生。

在這一策略中，由創(chuàng)新的二溴甲基酰胺（DBM）或二噻吩基馬來酰亞胺（DSPh）組成的異質(zhì)雙功能連接體可以通過區(qū)域特異性生物偶聯(lián)產(chǎn)生更均勻和更穩(wěn)定的ADC，DAR為4。

小結(jié)

在過去的十年中，ADCs已經(jīng)通過選擇更好的細(xì)胞毒性藥物、生物偶聯(lián)方法、更好的靶向抗原和優(yōu)化的抗體工程得到了改進(jìn)。然而，它仍存在一些局限性（如有限的實(shí)體瘤滲透性和毒性）以及耐藥機(jī)制的出現(xiàn)。

為了克服這些局限性，人們研究了新的抗體形式、新的傳遞系統(tǒng)、非內(nèi)化抗原靶點(diǎn)、新的細(xì)胞毒性藥物和位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)方法來促進(jìn)ADC的發(fā)展。雖然許多創(chuàng)新尚未在臨床方案中得到驗(yàn)證，但這一領(lǐng)域的研究為我們提供了許多令人鼓舞的結(jié)果。相信ADC未來的十年將會(huì)迎來更加輝煌的前景。

參考文獻(xiàn)：

1.The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442.

2. Antibody–Drug Conjugates: The Last Decade. Pharmaceuticals 2020, 13, 245

       原文標(biāo)題 : 帶你全面了解ADC