前言

Toll樣受體9（TLR9）是Toll樣受體家族的成員之一，其可被病原體來源的非甲基化磷酸胞苷鳥苷DNA（CpG DNA）或人工合成的含非甲基化CpG的寡核苷酸（CpG ODN）激活，并通過其下游信號傳導(dǎo)直接或間接啟動固有免疫反應(yīng)，從而抵抗病原體的入侵。

長期以來，TLR9一直被認(rèn)為是位于內(nèi)溶酶體中的細(xì)胞內(nèi)DNA傳感器。然而，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TLR9也可以在細(xì)胞膜表面表達(dá)，如中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞甚至紅細(xì)胞，被稱為表面TLR9（sTLR9）。此外，細(xì)胞免疫反應(yīng)的激活可以在細(xì)胞內(nèi)外的這兩個TLR9位點(diǎn)啟動，TLR9在細(xì)胞膜上的定位有助于激活內(nèi)體TLR9（eTLR9）介導(dǎo)的信號通路。sTLR9的存在可能有利于某些細(xì)胞類型或組織中的宿主反應(yīng)，例如紅細(xì)胞可以通過sTLR9介導(dǎo)巨噬細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞的激活，從而在炎癥狀態(tài)下加速自身的清除。因此，深入了解sTLR9的結(jié)構(gòu)特征、sTLR9與CpGDNA的關(guān)系，以及sTLR9在免疫細(xì)胞中的免疫調(diào)節(jié)作用，將為TLR9激動劑的臨床應(yīng)用提供理論參考。

sTLR9的結(jié)構(gòu)

sTLR9的結(jié)構(gòu)并不特別清楚，它是否與eTLR9相同也存在爭議。眾所周知，eTLR9屬于I型跨膜蛋白，由細(xì)胞外、跨膜和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域組成。eTLR9的胞外區(qū)位于內(nèi)體中，由25個富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRR）組成，其N-末端和C-末端分別稱為TLR9-N和TLR9-C。TLR9-N和TLR9-C可以通過天冬氨酸內(nèi)切酶釋放，該內(nèi)切酶作用于eTLR9中間的LLR14和LLR15之間的Z環(huán)結(jié)構(gòu)域，形成TLR9-N+C復(fù)合物，這是eTLR9的活性形式。

然而，sTLR9的結(jié)構(gòu)尚不清楚。一項研究表明，與TLR9-N結(jié)合的抗體完全不能與人外周中性粒細(xì)胞上的sTLR9結(jié)合，這可能表明這些中性粒細(xì)胞的sTLR9不是TLR9-N+C復(fù)合物的活性形式。而抗全長TLR9和抗TLR9-N的抗體都能識別B細(xì)胞上的sTLR9，這表明全長TLR9和TLR9-N存在于B細(xì)胞上。此外，識別TLR9-N的抗體可以檢測到樹突狀細(xì)胞（DC）上的sTLR9，但檢測不到脾臟中性粒細(xì)胞上的sTLR9，這表明DC和中性粒細(xì)胞的sTLR9構(gòu)象不同。這些研究給人的印象是，sTLR9的結(jié)構(gòu)可以是全長無活性形式，也可以是酶水解活性形式，這可能因細(xì)胞而異。

sTLR9的轉(zhuǎn)移

對于細(xì)胞內(nèi)TLR9，它可以位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）或內(nèi)體的膜上。對于組成性表達(dá)TLR9的細(xì)胞，如pDC和B細(xì)胞，在穩(wěn)態(tài)下，TLR9主要位于ER膜上。然而，當(dāng)TLR9配體如CpG-ODN刺激時，TLR9可以從ER膜遷移到內(nèi)溶酶體膜，成為eTLR9。這種重新定位過程依賴于幾種伴侶蛋白，包括Unc93B1、gp96和PRAT4A。Unc93B1是TLR9功能所需的多次跨膜蛋白，是控制TLR9從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向內(nèi)溶酶體運(yùn)輸?shù)淖铌P(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。Gp96和PRAT4A也與TLR9相互作用，并共同調(diào)控TLR9的折疊。

sTLR9也可以在Unc93B1和銜接蛋白2（AP2）的幫助下從細(xì)胞表面遷移到內(nèi)體，成為eTLR9。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜表面的Unc93B1通過其C末端YxxΦ基序募集AP2，然后與網(wǎng)格蛋白形成復(fù)合物，以幫助sTLR9轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)溶酶體膜上。在存在TLR9配體（如CpG-ODN）的情況下，sTLR9向IRF信號通路的偏向與I型干擾素的誘導(dǎo)有關(guān)，而sTLR9向NF-κB信號通路的偏向則與炎癥因子的誘導(dǎo)有關(guān)。

此外，在人pDC中，DC相關(guān)LAMP樣分子（BAD-LAMP）與Unc93B1一起，促進(jìn)TLR9從IRF信號向NF-κB信號的偏移，最終導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。目前，尚不清楚CpG DNA是如何產(chǎn)生啟動TLR9轉(zhuǎn)運(yùn)信號的，但據(jù)推測，不同位點(diǎn)TLR9數(shù)量的失衡可能是觸發(fā)TLR9遷移和重新定位的驅(qū)動力。

sTLR9與CpG-ODN的關(guān)系

到目前為止，sTLR9是否與TLR9配體CpG-ODN結(jié)合仍不確定，但對在中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞和紅細(xì)胞上表達(dá)的sTLR9的幾項研究表明，中性粒細(xì)胞上的sTLR9可以直接與CpG-ODN結(jié)合并被激活。對HEK293轉(zhuǎn)染細(xì)胞上表達(dá)的sTLR9的研究表明，sTLR9參與CpG-ODN刺激中的細(xì)胞內(nèi)信號通路，涉及MyD88、IRAK和TRAF6，表明定位在細(xì)胞表面的TLR9具有生物活性。此外，B細(xì)胞和紅細(xì)胞似乎也有類似的現(xiàn)象。

因此，sTLR9似乎具有識別和結(jié)合CpG-ODN的能力，但它是否能直接啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還需要進(jìn)一步研究。sTLR9是否能夠與TLR9配體結(jié)合是一個值得研究的課題，這有助于揭示TLR9在細(xì)胞膜表面出現(xiàn)的潛在生理意義，也有助于解釋其在自身免疫性疾病中的可能作用。

sTLR9的免疫調(diào)節(jié)作用

sTLR9對中性粒細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到了相對深入的研究。紅細(xì)胞作為人類免疫系統(tǒng)中一種新興的研究前沿，也表達(dá)sTLR9，它可以激活先天免疫反應(yīng)。

中性粒細(xì)胞

據(jù)報道，中性粒細(xì)胞能夠在病原體感染早期通過sTLR9介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CpG DNA不能進(jìn)入內(nèi)體或eTLR9不能被激活時，表達(dá)sTLR9的中性粒細(xì)胞可以感知細(xì)胞外病原體衍生的CpG DNA，并獨(dú)立于eTLR9啟動sTLR9介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。

一些研究表明，sTLR9+中性粒細(xì)胞可能在病原體感染中發(fā)揮陽性或陰性免疫調(diào)節(jié)作用，這取決于其位置或時間。一項基于D-半乳糖胺（D-GAL）聯(lián)合CpG-ODN誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）小鼠模型的研究表明，sTLR9+中性粒細(xì)胞可在炎癥部位產(chǎn)生TNF-α和IL-10。然而，SIRS誘導(dǎo)后1小時收集的sTLR9+中性粒細(xì)胞比6小時收集的產(chǎn)生更多的IL-10和更少的TNF-α，這表明炎癥初始階段的sTLR9+中性粒細(xì)胞可能更傾向于負(fù)向的免疫調(diào)節(jié)作用。此外，，在腫瘤中，sTLR9+中性粒細(xì)胞與免疫抑制分子如PD-L1和IL-10的高表達(dá)，以及免疫激活分子如TNF-α和ICAM1的表達(dá)減少有關(guān)，其比例也隨著腫瘤的進(jìn)展而增加，提示sTLR9+中性粒細(xì)胞具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)特性。通過使用TLR9激動劑下調(diào)早期腫瘤中性粒細(xì)胞上sTLR9的水平可以抑制腫瘤生長。

總之，無論是炎癥還是腫瘤，中性粒細(xì)胞表面sTLR9的存在似乎都是一種分子標(biāo)記，可以確定其是否發(fā)揮積極或消極的免疫調(diào)節(jié)作用，同時也賦予sTLR9免疫檢查點(diǎn)分子的特征。TLR9可能通過選擇性遷移發(fā)揮免疫檢查點(diǎn)或免疫激活的雙重作用，成為中性粒細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞獨(dú)特而快速的活性調(diào)節(jié)模式。

B細(xì)胞

最近的研究發(fā)現(xiàn)TLR9在B細(xì)胞表面表達(dá)，并參與B細(xì)胞的激活。根據(jù)研究報告，與健康對照組相比，膿毒癥患者外周血B細(xì)胞中sTLR9的表達(dá)顯著增加。sTLR9的激活可以抑制CpG-ODN單獨(dú)或與抗IgM抗體聯(lián)合誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖和CD25表達(dá)。在抗IgM抗體結(jié)合的B細(xì)胞受體（BCR）的情況下，sTLR9轉(zhuǎn)移到B細(xì)胞的脂筏，表明sTLR9可能在B細(xì)胞活化過程中分離，并且這種重新定位對于B細(xì)胞活化可能是至少部分必需的。

也有研究表明，sTLR9可能是靜息狀態(tài)B細(xì)胞拮抗eTLR9激活的一種負(fù)調(diào)控因子。當(dāng)B細(xì)胞通過eTLR9信號被激活時，sTLR9可以幫助eTLR9發(fā)揮其功能。此外，在一項研究中發(fā)現(xiàn)，在疫苗加CpG-ODN的刺激下，B細(xì)胞上的sTLR9內(nèi)化到細(xì)胞并與內(nèi)涵體膜蛋白共定位，伴隨著B細(xì)胞中sTLR9水平的降低和B細(xì)胞的活化，揭示了sTLR9在TLR9激動劑的作用下內(nèi)化為eTLR9。這些數(shù)據(jù)表明，CpG-ODN介導(dǎo)的B細(xì)胞活化的機(jī)制之一可能部分在于其誘導(dǎo)sTLR9在B細(xì)胞中重新定位，而sTLR9可能是避免TLR9介導(dǎo)過度B細(xì)胞激活的負(fù)調(diào)控因子。

紅細(xì)胞

最新研究表明，紅細(xì)胞不僅具有運(yùn)輸氧氣的功能，還具有免疫哨兵的作用，可以及時感知體內(nèi)病原體或損傷，發(fā)揮免疫細(xì)胞的功能。有趣的是，TLR9在紅細(xì)胞表面表達(dá)，這與先天免疫的激活和炎癥狀態(tài)下紅細(xì)胞的加速清除有關(guān)。

入侵人體的病原體和受損細(xì)胞都可以釋放CpG DNA，因此體內(nèi)游離CpG DNA水平升高，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病和敗血癥中通常可以檢測到。2018年，一項研究表明，紅細(xì)胞是清除CpG DNA和減輕肺組織損傷所必需的。sTLR9在人類和小鼠紅細(xì)胞表面表達(dá)，并能與大量游離CpG DNA結(jié)合。CD47與CpGDNA結(jié)合后，紅細(xì)胞表面的分子構(gòu)象發(fā)生變化，失去了原來的“不要吃我”的功能。當(dāng)這些紅細(xì)胞穿過包括肝臟和脾臟在內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)時，它們被巨噬細(xì)胞上表達(dá)的SIRPα快速識別，然后被巨噬細(xì)胞吞噬。因此，紅細(xì)胞以自殺傾向的方式清除CpG-DNA，這抑制了過度的炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)貧血的發(fā)生。盡管如此，能夠表達(dá)sTLR9的紅細(xì)胞只占很小的比例，它們在免疫調(diào)節(jié)中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

小結(jié)

TLR9可能出現(xiàn)在細(xì)胞膜上并作為穩(wěn)定和功能性受體的可能性特別令人感興趣。發(fā)現(xiàn)源自細(xì)胞表面TLR9的途徑可能揭示內(nèi)體TLR9新的功能，增強(qiáng)我們對炎癥或癌癥觸發(fā)的理解，并可能發(fā)現(xiàn)以前未知的sTLR9受體特異性配體。存在于質(zhì)膜上的TLR9可以作為治療靶點(diǎn)，幫助我們開發(fā)針對難以治療的罕見疾病的新治療方法。

參考文獻(xiàn)

1.Surfacetoll-like receptor 9 on immune cells and its immunomodulatory effect. FrontImmunol.2023 Sep 1;14:1259989

       原文標(biāo)題 : 免疫細(xì)胞表面的TLR9及其免疫調(diào)節(jié)作用