前言

腫瘤免疫治療已成為第三代腫瘤治療中最活躍的研究領域。過去的治療方法，如化療或放療，大多以直接殺傷腫瘤細胞為目的。由于缺乏特異性，這些療法經常會對免疫細胞產生副作用，導致患者免疫狀態(tài)的減弱。腫瘤靶向治療的發(fā)展是向個性化醫(yī)學方向邁進的一大步，它提高了針對腫瘤的特異性，限制了一些副作用。相比之下，過去幾十年的許多臨床研究表明，靶向腫瘤微環(huán)境（TME）并刺激抗腫瘤免疫反應可產生強健而持久的抗腫瘤作用。這導致了以PD－1、CTLA－4和PD－L1為靶點的免疫檢查點抑制（ICI）療法的監(jiān)管批準，并且該列表可能會隨著新的免疫檢查點的開發(fā)（如TIM－3、LAG－3和TIGIT）而繼續(xù)擴大。ICI治療的主要目的是維持先前建立的抗腫瘤活性。相比之下，刺激性免疫治療靶點，如CD40、ICOS、CD27、GITR、OX40和4－1BB則用激動劑來激活免疫，主要集中在免疫反應的早期階段。這些分子最先起作用的很可能是CD40，因為它在抗原呈遞過程中起著關鍵作用，間接地激活T細胞。

CD40／CD40L的表達

為了獲得強大而特異的免疫反應，固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)需要在多個環(huán)節(jié)上進行協(xié)調。免疫反應的許多關鍵階段是由腫瘤壞死因子超家族（TNFSF）的配體及其受體介導的，包括CD40／CD40L�？乖�特異性T細胞的有效抗原識別關鍵取決于特異性抗原呈遞細胞（APC）的存在和功能，如B細胞和DC細胞。這些APC通常在細胞表面表達共刺激表面受體CD40（TNFRSF5）。

CD40是一種48kda大小的Ⅰ型跨膜蛋白，是連接固有免疫和適應性免疫的重要免疫細胞通訊介質。CD40存在于血小板、B細胞和髓系細胞，但也存在于非造血細胞，如內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞甚至某些類型的腫瘤細胞。CD40的同源配體是CD154（TNFSF5／CD40L），一種39kda的II型跨膜蛋白。CD40L的表達通�？烧T導并局限于造血系統(tǒng)的細胞，如血小板、粒細胞、活化T細胞、活化B細胞和活化自然殺傷細胞（NK）細胞，但內皮細胞和平滑肌細胞也有弱表達。

CD40／CD40L的生物學相關性

CD40在單核細胞及其子代巨噬細胞和DC細胞以及B細胞上的表達在發(fā)揮免疫細胞的功能中起著重要作用。單核細胞是固有免疫前體細胞，具有很高的可塑性。它們具有分化為多種細胞類型的能力，如巨噬細胞、髓源性抑制細胞（MDSC）和DC細胞。CD40信號是單核細胞成熟過程的重要觸發(fā)因素，主要驅動分化為M1譜系的巨噬細胞和DC細胞。CD40與DC細胞表面的結合促進了細胞因子和趨化因子的產生，誘導共刺激分子的表達，并促進抗原的交叉呈遞。CD40L的主要功能之一是通過激活DC細胞來增強抗原對T細胞的提呈。這一步稱為“許可”，通過上調表面蛋白如CD54和CD86，增加DC與T細胞的相互作用，從而激活后者。

B細胞也是CD40L活性的靶點。在胸腺中，T細胞和B細胞之間廣泛的串擾使之必須維持表達CD40的B細胞，從而保持自體反應性T細胞對B細胞的陰性選擇。B細胞與CD4＋T細胞的直接相互作用誘導T細胞表達CD40L，進而保護B細胞不受凋亡的影響。在這個功能中，CD40L通過激活PI3K／Akt提供一個生存信號，使活化的B細胞維持壽命并向漿細胞分化。抗原特異性B細胞通過CD40的穩(wěn)態(tài)增殖和生存機制是通過抗凋亡成員Bcl－2家族的上調來維持的。事實上，CD40／CD40L系統(tǒng)的缺陷與B細胞的抗體類別轉換以及細胞超突變的缺陷（hyper－IgM綜合征）有關。

B細胞與活化的表達CD40L的T細胞的相互作用也增加了MHC－II和CD80或CD86等共刺激分子的表達，并誘導B細胞中的Ig類別轉換�；罨�的B細胞遷移到淋巴器官，在那里向T細胞呈遞抗原，CD40激活的DC和B細胞通過釋放免疫刺激性細胞因子和趨化因子如IL－6、IL－12p70、IFNγ、CXCL10和TNFα來支持免疫應答。此外，CD40活化的B細胞能夠通過促進TNFα和IFNγ等細胞因子的分泌來誘導抗原特異性CD8＋T細胞。一些研究證明，體外活化的表達CD40的B細胞是完全功能性抗原提呈的B細胞，隨后用這些細胞進行過繼細胞轉移（ACT）治療可提高抗腫瘤的療效。

CD40／CD40L與腫瘤免疫治療的相關性

數十年來，CD40／CD40L信號傳導同步免疫反應的固有、細胞和體液分支的非凡能力激發(fā)了基礎和臨床研究的靈感。鑒于CD40的一般表達譜和生物學活性，人們已經做了許多嘗試來探索CD40／CD40L信號在抗腫瘤免疫中的作用。

CD40激活的DC細胞可用于癌癥和傳染性疾�。ㄈ缃Y核病）的疫苗治療。CD40信號的另一個有趣結果是表型從“另類活化”的M2型向抗腫瘤或“經典活化”的M1型的轉變。這種M1／M2型的命名與腫瘤相關巨噬細胞（TAM）在腫瘤免疫治療中特別相關。所謂的M1型的“經典活化”巨噬細胞產生于對GM－CSF以及IFNγ和LPS等刺激物的反應，通常被認為具有促炎性免疫反應和抗原交叉呈遞的作用。M1型巨噬細胞主要與良好的抗腫瘤免疫反應相關�！傲眍惢罨�”的M2型巨噬細胞是由于暴露于M－CSF和細胞因子（如IL－4和IL－10）而產生的，并參與組織修復和消除炎癥狀態(tài)。腫瘤相關的M2型被認為是癌癥進展和轉移的關鍵驅動因素。腫瘤和浸潤性巨噬細胞的緊密相互作用強烈地塑造了腫瘤微環(huán)境，從而建立了炎癥或促腫瘤的局部條件。有人提出，改善腫瘤內M2／M1譜系的平衡可以通過促進細胞毒性T細胞的浸潤和激活來提高抗腫瘤免疫反應。這一點已經在多個模型中進行了描述，例如胰腺癌和小鼠異種移植膠質母細胞瘤模型。巨噬細胞復極化與CD40活化誘導CD206下調和CD54表達增加一致，表明巨噬細胞遷移能力的改變和有效激活。

有趣的是，盡管CD40在許多組織中廣泛表達，腫瘤細胞似乎更易受膜結合CD40L誘導的CD40殺傷。在B16黑色素瘤小鼠模型中，DC細胞上表達的膜結合CD40L可直接誘導CD40陽性腫瘤細胞凋亡，而非T細胞依賴的的細胞生長抑制活性則源于CD40刺激的IFNγ激活的巨噬細胞。這一現象的部分原因可能不是CD40信號的直接作用，而是對易感細胞類型死亡受體的二次上調。然而，抗CD40抗體Lucatumumab和dacetuzumab對B細胞惡性腫瘤有一定的臨床效果，這可能歸因于抗體介導的巨噬細胞吞噬和抗體依賴性細胞毒性（ADCC）的作用。連接CD40后，腫瘤細胞顯示出DNA損傷的跡象，分泌促血管生成因子，如VEGF和IL－8，并且通常表現出衰老相關分泌表型（SASP）的狀態(tài)，這是由于CD40誘導的NFκB通路的激活。

CD40／CD40L的結構、組成及信號通路

TNF－R－SF信號傳導的結構已經比較明確，需要恰當的三維受體聚集和三聚體化。雖然TNF－SF配體天然以三價功能單位存在，但受體通常分散分布在細胞表面。TNF－SF配體以同源三聚體的形式自然地聚集在細胞表面，其中三個受體結合位點位于相鄰單體之間的三個完全相同的縫隙處。關鍵的是，受體組裝成功能性的三聚體復合物是通過天然配體單元的結合發(fā)生的。這些三聚體TNF－SF配體與在其他細胞表面表達的相應受體的相互作用導致了非常精確的受體聚集。配體對細胞外受體的指令傳遞給鄰近的受體細胞內結構域，然后是細胞內信號復合物的有序組裝。TNF－SF配體的三聚體結構和由此產生的受體簇是信號傳遞到細胞的前提。由于這種特殊的要求，一價和二價的結構在體內通常被證明是極低效的。

與TNF－R－SF的其他成員一樣，CD40是一種膜結合分子，可以通過細胞間直接接觸被膜結合配體激活，也可以被溶液中的可溶性配體激活。多種下游分子和細胞反應進程已被證明受到CD40結合的調節(jié)。同源配體連接受體可誘導形成空間上明確的三聚體信號復合物，促進TNF受體相關因子（TRAFs）和NFκB激活劑－1（Act1）的招募。信號復合物的特定組成，主要取決于細胞類型，觸發(fā)各種途徑。例如，與TRAF6的結合主要激活JAK／Stat3通路，TRAF1／2誘導MKK／p38／ERK1／2信號傳導，Act1在NFkB通路、JNK和PI3K信號傳導中具有多種功能，并與TRAF3一起放大MKK／p38／ERK1／2信號。此外，根據特定的環(huán)境，CD40結合可以激活“經典”和非典型的NFkB通路。

CD40激動劑的開發(fā)

基于其獨特的受體聚集模式，從TNF－R－SF產生的下游信號依賴于具有非常精確的結構和三維組成的激動劑化合物。由于CD40在抗腫瘤免疫反應中發(fā)揮關鍵作用，誘導CD40信號的各種策略已經被廣泛地研究探索。大致可分為基于激動劑抗體的方法或基于CD40L的方法。后者可進一步分為使用CD40L類似物的重組蛋白方法和將CD40L基因導入靶細胞的基因治療方法。第一個CD40靶向的臨床試驗始于20多年前。這些初步試驗測試了重組CD40L和過度表達CD40L的細胞疫苗。第一個激動劑抗體試驗，使用CP－870893和SGN－40，大約在五年后開始。這些早期臨床試驗顯示了一些令人鼓舞的結果；目前，有7種抗體和4種基于CD40L的方法正在進行臨床試驗中。

抗體：抗體最重要的特征是其同源表位的高度特異性�？贵w可以特異性地結合到給定蛋白質上的多個獨特的表位，包括線性表位和構象表位。重要的是，表位的位置在活性中起著至關重要的作用。這最初是通過顯示具有不同表位的抗體在結合后產生不同的CD40信號級聯(lián)來證明的。其中抗人CD40抗體的刺激活性隨著表位變得更接近細胞膜而降低。

有趣的是，人們推測表位位置的重要性實際上與Fc域的可及性有關。具體地說，當抗體的Fc結構域與細胞表面的遠端結合時，Fcγ受體（FcγR）可接近，但與膜結合較近的抗體的Fc結構域將無法最佳地與FcγR結合。這突出了抗原結合位點和Fc結構域在活性中發(fā)揮作用的重要性。由于其雙價性質，除非交聯(lián)，否則抗CD40抗體不會提供顯著療效所需的聚集能力。事實上，治療性抗體，尤其是抗CD40抗體，通常依賴于通過Fcγ受體（FcγR）的二次交聯(lián)來獲得生物活性。這些Fc／FcR相互作用產生其他的反應。例如，Fc區(qū)域介導靶細胞的CDC或ADCC作用。事實上，ADCC是抗CD40抗體Lucatumab在治療慢性淋巴細胞性淋巴瘤以及其他用于癌癥治療的抗體，如曲妥珠單抗（anti－HER2）、利妥昔單抗（rituximab，抗CD20）和伐利侖單抗（Varliumab，anti－CD27）活性的根本原因。這意味著抗體的兩端在發(fā)揮生物學功能時都具有重要的作用。就抗CD40抗體而言，這也意味著它們具有混合的作用模式。當討論抗CD40抗體的治療指標，比較療效和安全性時，這一點變得尤為重要。

早期抗CD40抗體缺乏顯著的臨床活性促使人們對其進行了許多改進。目前，七種獨特的抗CD40抗體正在進行臨床試驗，包括CP－870893，并且最近發(fā)表了一些新的結果，這些新的研究集中在新的表位、新的Fc區(qū)域設計，以及聯(lián)合治療，以改善以往觀察到的有限的臨床療效。

基于CD40L的細胞和基因治療：最早的CD40靶向方法涉及在不同細胞群中構建CD40L的過度表達。目前，可進一步分為兩種主要方法：表達CD40L的細胞疫苗和使用溶瘤病毒等載體系統(tǒng)的CD40L特異性基因治療。另外，由于樹突狀細胞是CD40L和抗原交叉呈遞的主要靶細胞之一，提高這種細胞類型的療效和敏感性的一種方法是用CD40轉導并隨后作為改進的疫苗載體使用。一種體內激活誘導性CD40的自體樹突狀細胞疫苗已經用于晚期前列腺癌的臨床試驗。

之前使用這些方法的臨床試驗表現出有限的臨床活性。最近的一些進展，包括正在進行的臨床試驗和發(fā)表的文章，已經證明了這些方法的潛力。例如，在臨床前模型中，表達CD40L的嵌合抗原受體（CAR）T細胞顯示出增強的抗腫瘤活性。這種方法結合了CAR－T細胞靶向的特異性和基于CD40L的共刺激，使其成為“細胞雙特異性”。顯然，研究結果表明，細胞疫苗并不是唯一一種可以從靶向CD40中獲益的過繼細胞療法（ACT）。CD40L的遞送方式和模式的進一步發(fā)展也顯示出了一些前景。

基于CD40L的重組蛋白（天然配體類似物）：最后一種方法是直接注射可溶性重組CD40L，這些蛋白是內源性CD40L的分子類似物，通過受體結合域與CD40特異性地相互作用。這已經通過使用純化的CD40L、穩(wěn)定的三價／三聚體形式和最近的六價／六聚體形式的CD40L來實現。如前所述，CD40需要正確地三聚體以傳遞有效的信號。雖然純化的CD40L在溶液中容易三聚，但CD40L的方法并不是很成功。然而，穩(wěn)定的三聚體形式，如異亮氨酸拉鏈CD40L形式，在與IL－6阻斷劑結合時表現出一些活性。