mRNA疫苗的設計和載體
疫苗是預防傳染性疾病傳播的最有效的公共衛(wèi)生干預措施。成功的疫苗接種根除了許多威脅生命的疾病,如天花和脊髓灰質炎,世界衛(wèi)生組織估計疫苗每年可防止200-300萬人死于破傷風、百日咳、流感和麻疹。然而,盡管常規(guī)疫苗取得了明顯的成功,但它們并不能有效對付瘧原蟲、丙型肝炎和HIV等逃避免疫監(jiān)視的病原體。此外,它們需要定期修改以應對快速變異的病原體,如流感病毒。
基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的,希望能產生安全、多功能、易于生產的疫苗。mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點:與某些病毒疫苗不同,mRNA不會整合到基因組中,從而避免了對插入突變的擔憂;mRNA疫苗可以以無細胞的方式制造,從而實現快速、經濟、高效的生產。此外,單個mRNA疫苗可以編碼多種抗原,增強針對適應性病原體的免疫反應,并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體。
最初,由于擔心其穩(wěn)定性、低效性和過度免疫刺激,mRNA治療并沒有得到重視。然而在過去的十年中,mRNA治療領域日新月異,包括mRNA藥理學的深入研究,有效載體的開發(fā)和mRNA免疫原性的控制,使得mRNA疫苗的臨床應用進入了一個嶄新的階段。
mRNA的設計與合成
體外轉錄(IVT)mRNA模擬內源性mRNA的結構,有五個部分,從5?到3?包括:5?cap,5?非翻譯區(qū)(UTR),一個編碼抗原的開放閱讀框,3?UTR和一個PolyA尾。
與天然真核mRNAs一樣,5′端帽結構包含一個7-甲基鳥苷核苷,5′端結構會在空間上保護mRNA不被核酸外切酶降解,并與翻譯起始因子蛋白協同工作,招募核糖體以啟動翻譯。PolyA尾的長度間接調節(jié)mRNA翻譯和半衰期。
編碼區(qū)兩側的5′和3′UTR調節(jié)mRNA翻譯、半衰期和亞細胞定位,來自高表達基因(如α-和β-珠蛋白基因)的天然UTR是合成mRNAs的首選。此外,UTR可根據細胞類型進行優(yōu)化,如通過去除3′UTR中的miRNA結合位點和富含AU的區(qū)域,將mRNA降解降至最低。
mRNA疫苗的開放閱讀框是最關鍵的組成部分,盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性,但可以通過優(yōu)化密碼子,從而在不改變蛋白質序列的情況下增加翻譯。例如,CureVac AG公司發(fā)現人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U,從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優(yōu)化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV,目前正處于III期試驗階段。
為了最大化翻譯,mRNA序列通常包含修飾的核苷,例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用,特別是修飾尿苷,阻止了模式識別受體的識別,保證了翻譯過程產生足夠水平的蛋白質。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識別受體檢測的策略,由CureVac首創(chuàng),使用序列工程化和密碼子優(yōu)化,通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。
除了mRNA序列的改進外,在簡化mRNA生產方面也取得了重大進展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7(也可以使用T3和SP6聚合酶)從DNA質粒在體外轉錄。另外,使用CleanCap的共轉錄封蓋技術,簡化了純化步驟。
mRNA疫苗的載體
由于mRNA較大(104–106Da)且?guī)ж撾,因此無法通過細胞膜的陰離子脂質雙層。此外,在體內,它會被先天免疫系統(tǒng)的細胞吞噬,并被核酸酶降解。因此,體內應用需要使用mRNA遞送載體,該載體轉染免疫細胞而不會引起毒性或不必要的免疫原性。目前,已經為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。
脂質納米顆粒(LNP)
脂質納米顆粒是臨床上最先進的mRNA載體。截至2021年6月,所有正在研制或批準臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處,包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外,LNP通常包括四種成分,可電離脂質、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質,它們共同封裝和保護脆弱的mRNA。
可電離脂質與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒,使脂質帶正電荷并吸引RNA。此外,它們在內涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷,這促進了它們與內涵體膜的融合,將其釋放到細胞質中。
DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質。通過設計提高DODMA的功效,產生了DLin-MC3-DMA。這是第一個FDA批準的藥物制劑中使用的可電離脂質:siRNA藥物patisiran(Onpattro)。除了有效且安全地遞送siRNA外,DLin-MC3-DMA還用于mRNA的遞送。
目前,學術界和工業(yè)界的許多團體使用組合反應方案來合成潛在的傳遞材料,這種方法產生了許多有效的脂質,包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102(用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273)和ALC-0315(用于輝瑞疫苗BNT162b2)。
除了尋求提高療效外,人們越來越關注提高藥物的特異性,特別是對疫苗和免疫療法的特異性。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質11-A-M58,和含有環(huán)咪唑頭的脂質93-O17S59,已被設計用于體內靶向T細胞。盡管機制尚不清楚,但這些脂質的環(huán)狀基團對于靶向T細胞至關重要。
盡管電離脂質可以說是LNP最重要的成分,但其他三種脂質成分(膽固醇、輔助脂質和聚乙二醇化脂質)也促進了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質,它通過填充脂質之間的空隙來增強納米顆粒的穩(wěn)定性,并有助于在攝取到細胞的過程中與內涵體膜融合。
輔助脂質通過促進有助于膜與內涵體融合的脂質相變來調節(jié)納米顆粒的流動性并增強功效。最佳輔助脂質的選擇取決于可電離脂質材料和RNA載體。例如,對于類脂質材料,飽和輔助脂質(如DSPC)最適合傳遞短RNA(如siRNA),而不飽和脂質(如DOPE)最適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。
LNPs的聚乙二醇化脂質成分由聚乙二醇(PEG)與錨定脂質(如DMPE或DMG)結合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP,通過限制脂質融合調節(jié)納米顆粒大小,并通過減少與巨噬細胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂質。
聚合物和聚合物納米顆粒
盡管臨床進展不如LNP,但聚合物具有與脂質相似的優(yōu)勢,能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復合物,可通過內吞作用進入細胞。
聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效卓越,但由于其高電荷密度,其毒性限制了應用。此外,已經開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如,聚(β-氨基酯)在mRNA傳遞方面表現出色,尤其是對肺。
最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物,稱為電荷改變可釋放轉運體(CARTs),它能有效地靶向T細胞,操縱T細胞是非常困難的,因此,CART 是一種極具吸引力的傳遞材料,在mRNA疫苗和基因治療領域具有巨大潛力。
其他遞送系統(tǒng)
除了脂質和聚合物載體外,肽也可以將mRNA傳遞到細胞中,這要歸功于其主鏈和側鏈中的陽離子或兩親胺基(例如精氨酸),這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結合并形成納米復合物。例如,含有重復的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(RALA)基序的膜融合細胞穿透肽。
富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷,也可以濃縮mRNA并促進其傳遞。魚精蛋白與mRNA復合物激活識別單鏈mRNA的Toll樣受體(TLR7,TLR8)通路,因此,它還可以作為疫苗或免疫治療應用的佐劑。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive,用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細胞肺癌的臨床試驗。
最后,基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA,這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑,如諾華的MF59,在FDA批準的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細胞分泌趨化因子,從而招募抗原呈遞細胞,誘導單核細胞分化為樹突狀細胞,并增強抗原呈遞細胞對抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內涵體逃逸并將mRNA輸送到細胞質中的機制尚不清楚。
mRNA疫苗技術創(chuàng)新
mRNA疫苗技術最重要的創(chuàng)新在于:mRNA 序列設計;開發(fā)簡單、快速和大規(guī)模生產 mRNA 的方法;開發(fā)高效、安全的 mRNA 疫苗遞送材料。
最近的一項研究使用了一種基于細胞培養(yǎng)的系統(tǒng)選擇過程來識別新的UTRs,它顯著增加了IVT mRNA的蛋白質表達。與人類β-珠蛋白3’UTR的相比,這些序列可以誘導相關轉錄物產生大約3倍的蛋白質。
此外,最近報道了一種有趣的新疫苗形式,該方法利用編碼α病毒RNA依賴性RNA聚合酶的mRNA加上編碼抗原的第二個mRNA,使其在細胞質中能夠復制。這種系統(tǒng)可以在非常低的劑量(50ng)就有效地誘導小鼠的保護性免疫反應。這些發(fā)現特別有吸引力,因為低劑量的使用降低了疫苗生產的成本。無遞送材料進一步降低了成本,簡化了制造,并且提高了疫苗凍干和在環(huán)境溫度下儲存的可能性。
在生產方面,除了cleancap技術外,最近開發(fā)了一種通過將雙鏈RNA污染物吸附到纖維素(一種廉價且豐富的多糖)來純化mRNA的簡單方法。研究證明,這種高度可擴展且廉價的方法與高效液相色譜法一樣有效地去除IVT mRNA樣本中的dsRNA污染物。
在遞送材料方面,與基于聚合物的CART平臺類似,mRNA-LNPs也實現了選擇性T細胞靶向。一種新的平臺,稱為ASSET(錨定二級靶向單鏈抗體),其中T細胞特異性單克隆抗體與LNP相連,以靶向T細胞。這種靈活的平臺在mRNA疫苗和其他應用方面也有很大的潛力。
另外一種脂質復合物在全身給藥后優(yōu)先靶向樹突狀細胞。用mRNA疫苗選擇性靶向DC以誘導強烈的免疫反應是一個潛在的關鍵發(fā)現,該平臺已經在臨床試驗中證明了其前景。
小結
過去幾年在mRNA疫苗領域取得了極其重要的進展,并為這種新型疫苗模式的可行性提供了證據。新的制造方法和遞送材料將有助于快速、廉價地大規(guī)模生產下一代mRNA疫苗。同樣還有許多地方需要深入研究,以及更全面地了解各種mRNA疫苗類型的作用機制,以進一步地優(yōu)化mRNA疫苗技術。
參考文獻:
1. mRNA vaccines forinfectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat RevDrug Discov. 2021 Aug 25 : 1–22.
2. Recent advances in mRNA vaccine technology. Curr Opin Immunol. 2020 Aug;65:14-20.
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