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非病毒性CAR-T的過(guò)去、現(xiàn)在和未來(lái)

前言

過(guò)繼轉(zhuǎn)移嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞是一項(xiàng)強(qiáng)有力的技術(shù),它徹底改變了免疫治療的方式。其在難治性和復(fù)發(fā)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤中完全和長(zhǎng)期的療效令人印象深刻,這也為實(shí)體腫瘤的治療開(kāi)辟了新的可能性。然而,細(xì)胞治療的廣泛應(yīng)用受到了T細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用病毒載體自身局限的阻礙。在mRNA疫苗和CRISPR/Cas9精準(zhǔn)基因編輯的時(shí)代,新的無(wú)病毒T細(xì)胞工程化方法正在成為下一代CAR-T細(xì)胞制造的更通用、靈活和可持續(xù)的替代方法。

病毒載體CAR-T細(xì)胞的局限

迄今為止,臨床試驗(yàn)中批準(zhǔn)或研究的大多數(shù)CAR-T細(xì)胞治療都是利用病毒載體,特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體。病毒載體是具有高效基因轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期應(yīng)用歷史的標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng),已經(jīng)證明了在過(guò)繼性T細(xì)胞治療的安全性。

然而,病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)長(zhǎng)基因的能力受到衣殼的限制。病毒衣殼直徑大約為100nm,通常不能容納超過(guò)8-9 kb的基因。然而,隨著CAR-T技術(shù)的更新迭代,需要轉(zhuǎn)入額外的激活原件或者不同特異性的CAR,實(shí)現(xiàn)更高的藥效、安全性和適用性。

此外,臨床應(yīng)用的病毒生產(chǎn)通常需要兩到三周的時(shí)間,在GMP條件下和生物安全2級(jí)(BSL2)設(shè)施中進(jìn)行,需要經(jīng)過(guò)熟練培訓(xùn)的員工。這種高成本、復(fù)雜性以及個(gè)性化治療的需要最終影響了CAR-T產(chǎn)品的價(jià)格,可能達(dá)到每人數(shù)十萬(wàn)美元,使普通的患者望而生畏。

最后,病毒載體具有固有的免疫原性風(fēng)險(xiǎn),這是由對(duì)載體編碼表位的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)引起的,這可能限制轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效力和持久性。

T細(xì)胞工程化的非病毒方法

諾貝爾獎(jiǎng)獲得者遺傳學(xué)家芭芭拉·麥克林托克Barbara McClintock在20世紀(jì)40年代研究玉米籽粒顏色變異時(shí),最初發(fā)現(xiàn)了基因組中存在移動(dòng)序列。玉米中的這些“跳躍基因”當(dāng)時(shí)被稱為轉(zhuǎn)座因子(TE)或轉(zhuǎn)座子。

TE分為兩類,逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子使用RNA中間體通過(guò)復(fù)制粘貼機(jī)制移動(dòng),代表人類基因組中最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)座子類。DNA轉(zhuǎn)座子通過(guò)DNA中間體移動(dòng),并用于基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用。大多數(shù)DNA轉(zhuǎn)座子家族都有一個(gè)編碼轉(zhuǎn)座酶基因的元件,其兩側(cè)是反向末端重復(fù)序列(ITR)。轉(zhuǎn)座酶識(shí)別并結(jié)合整合到ITRs中的元件,催化將轉(zhuǎn)座因子從其原始位置切除,并將其整合到基因組中的另一個(gè)位置。目前,廣泛使用的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),包括Sleeping Beauty(SB)和piggyBac(PB)。非病毒轉(zhuǎn)座子載體具有多功能性、低免疫原性和易于生產(chǎn)的特性。然而,它們通常比病毒的轉(zhuǎn)染效率低。

mRNA的非病毒傳遞通常通過(guò)電穿孔或納米顆粒實(shí)現(xiàn)。一旦進(jìn)入細(xì)胞且不需要到達(dá)細(xì)胞核,mRNA被翻譯成編碼的蛋白質(zhì),并且通常在2-4次細(xì)胞分裂后丟失,這種方法避免了整合載體相關(guān)的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn),使該策略成為CAR-T細(xì)胞中一個(gè)安全的良好方法。

睡美人轉(zhuǎn)座子

在長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化“睡眠”后醒來(lái),魚(yú)類基因組中發(fā)現(xiàn)的SB,成為第一個(gè)在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中顯示活性的轉(zhuǎn)座子,從而為基因治療開(kāi)辟了新的視野;诮(jīng)典的Tc1/mariner DNA II類TE,這些“跳躍”單元能夠通過(guò)剪切粘貼機(jī)制從一個(gè)基因組位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基因組位置。SB載體由兩個(gè)功能組分組成:轉(zhuǎn)座子DNA,它攜帶有ITR側(cè)翼的感興趣基因,以及SB轉(zhuǎn)座酶,它識(shí)別ITR序列,并將轉(zhuǎn)基因從供體DNA動(dòng)員到基因組內(nèi)的受體位點(diǎn)。

與病毒系統(tǒng)相比,這種策略的一大優(yōu)勢(shì)是更大的裝載能力。插入物的大小與轉(zhuǎn)座機(jī)制的效率呈負(fù)相關(guān)。最佳裝載大小不高于6kb。但其升級(jí)版本包括兩個(gè)完整的轉(zhuǎn)座子單元,可以將負(fù)載增加到11kb,從而擴(kuò)充了基于SB載體的克隆能力。此外,當(dāng)與細(xì)菌人工染色體(BACs)結(jié)合時(shí),SB在人類胚胎干細(xì)胞中可以傳遞高達(dá)100 kb的轉(zhuǎn)基因。

在臨床應(yīng)用方面,Cooper等人的團(tuán)隊(duì)首次將SB工程化抗CD19 CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于臨床試驗(yàn),兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)(NCT00968760、NCT01497184)證實(shí)了SB工程化抗CD19 CAR-T細(xì)胞在26例B-ALL和非霍奇金淋巴瘤患者自體或異基因造血干細(xì)胞移植(HSCT)后作為輔助治療的安全性。

此外,目前還有正在美國(guó)和歐洲使用SB平臺(tái)進(jìn)行的CAR-T研究。UltraCAR-T平臺(tái)基于非病毒系統(tǒng)通過(guò)SB載體傳遞多個(gè)基因,利用該平臺(tái),正在CD33 CAR和mbIL15(PRGN-3006)的自體細(xì)胞,用于治療r/r急性髓系白血病和高危骨髓增生異常綜合征(MDS)。目前,PRGN-3006正在一項(xiàng)劑量遞增/擴(kuò)展研究(NCT03927261)中,評(píng)估在r/r急性髓系白血病核高危MDS成年患者中的安全性。初步數(shù)據(jù)表明,PRGN-3006輸注具有良好的耐受性,在接受淋巴濾過(guò)治療的患者中獲得50%的緩解率,與CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增和持續(xù)性相關(guān)。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子

與SB載體一樣,PB系統(tǒng)由PB轉(zhuǎn)座酶(PBase)構(gòu)成,其形式為mRNA或DNA,以及攜帶所需基因的單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。PB轉(zhuǎn)座子載體的設(shè)計(jì)以單個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)為特征,其兩側(cè)是ITR,PB中的ITR具有特征性的不對(duì)稱性。轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的ITR,并通過(guò)剪切粘貼機(jī)制將轉(zhuǎn)基因整合到基因組DNA中。PB在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有比SB更高的轉(zhuǎn)座子動(dòng)員轉(zhuǎn)座活性,比病毒載體具有更大的裝載能力(高達(dá)14 kb),并允許通過(guò)設(shè)計(jì)多順?lè)醋雍羞M(jìn)行多個(gè)轉(zhuǎn)基因傳遞。

目前,越來(lái)越多的臨床前數(shù)據(jù)支持基于PB的CAR-T制造平臺(tái)的可行性和安全性,這使得該系統(tǒng)能夠進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在澳大利亞開(kāi)展的CARTELL試驗(yàn)是一項(xiàng)I期臨床研究(ACTRN12617001579381),旨在研究通過(guò)PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得的供體衍生抗CD19 CAR-T細(xì)胞的療效和安全性。早期結(jié)果表明,其活性類似于用高應(yīng)答率病毒載體生成的抗CD19 CAR-T細(xì)胞。另外,分別在日本(UMIN000030984)和中國(guó)(NCT04289220)進(jìn)行的兩項(xiàng)I期研究正在調(diào)查使用PB系統(tǒng)制造的抗CD19 CAR-T細(xì)胞的可行性和安全性。在日本的研究中,到目前為止,沒(méi)有一名患者顯示出劑量限制性毒性。一名患者表現(xiàn)出持續(xù)9個(gè)月的B細(xì)胞再生障礙。

雖然轉(zhuǎn)座子工程化的CAR-T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中都處于初始階段,但一些已經(jīng)表現(xiàn)出一定的臨床療效?笲CMA CAR-T細(xì)胞(P-BCMA-101)通過(guò)PB平臺(tái)設(shè)計(jì),為了改善轉(zhuǎn)座,其在研究過(guò)程中改變了制造工藝,包括使用納米質(zhì)粒,以減少骨架尺寸并使ITR更接近。細(xì)胞產(chǎn)物顯示出高組成的記憶干T細(xì)胞(TSCM)。90名R/R MM患者接受了P-BCMA-101治療,早期結(jié)果顯示,初始劑量遞增的總有效率(ORR)為57%,與利妥昔單抗聯(lián)合使用的ORR為73%,毒性很低(NCT03288493)。

mRNA

30多年前,Malone的開(kāi)創(chuàng)性研究表明,與脂質(zhì)混合的RNA可以被人類細(xì)胞吸收并從中翻譯蛋白質(zhì)。從那時(shí)起,RNA就被用于基因工程的多個(gè)方面,例如恢復(fù)突變基因的功能表達(dá),敲除基因以沉默表達(dá),修改細(xì)胞表型或編碼抗原。RNA成功表達(dá)蛋白質(zhì)取決于其穩(wěn)定性和翻譯效率。這些特征由順式作用元件決定,例如5’帽結(jié)構(gòu)、polyA尾、編碼序列的組成以及可能存在于分子5’和3’端的非編碼區(qū)域。

RNA適合多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,包括電穿孔、陽(yáng)離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子聚合物。已經(jīng)有許多體外和體內(nèi)臨床前研究,通過(guò)mRNA將CAR引入T細(xì)胞,用于在血液腫瘤和實(shí)體瘤的模型系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試。雖然基于mRNA的治療被證明可以減少靶向效應(yīng)、降低毒性并緩解整合相關(guān)的安全性問(wèn)題,但蛋白質(zhì)表達(dá)的瞬時(shí)性在這些應(yīng)用中也是一個(gè)缺點(diǎn)。

淋巴細(xì)胞遺傳修飾的另一種方法是以DNA的形式將感興趣的轉(zhuǎn)基因與編碼轉(zhuǎn)座酶的RNA一起轉(zhuǎn)染。當(dāng)與編碼目的基因的DNA載體一起共轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞時(shí),以mRNA形式編碼轉(zhuǎn)座酶有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先,轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的瞬時(shí)性降低了轉(zhuǎn)座子重新切除和重新整合引起的二次轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生率;其次,這種方法可以精確滴定SB mRNA和CAR DNA的比率,以實(shí)現(xiàn)持久整合。

從mRNA瞬時(shí)表達(dá)CAR的潛在安全優(yōu)勢(shì)可能在血液學(xué)和實(shí)體瘤環(huán)境中提供較低的毒性。已有臨床研究對(duì)以CD123和CD19為靶點(diǎn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤以及以間皮素和c-Met為靶點(diǎn)的實(shí)體腫瘤進(jìn)行測(cè)試。雖然已有的研究報(bào)告顯示基于mRNA的CAR-T細(xì)胞是安全的,通常沒(méi)有嚴(yán)重的不良事件,但一個(gè)共同點(diǎn)是需要重復(fù)給藥3-6個(gè)高劑量。需要多次輸注高劑量的mRNA CAR-T細(xì)胞很可能與缺乏轉(zhuǎn)基因細(xì)胞持久性有關(guān),旨在延長(zhǎng)這些患者體內(nèi)活動(dòng)的持續(xù)時(shí)間,但重復(fù)給藥可能會(huì)導(dǎo)致其他并發(fā)癥。

非病毒性CAR-T細(xì)胞治療的未來(lái)

納米載體

為了應(yīng)對(duì)未來(lái)的挑戰(zhàn),除了轉(zhuǎn)座子平臺(tái)外,基因工程的另一個(gè)非病毒工具是納米載體,納米載體的使用正在成為一種可能的解決方案,以克服目前基因傳遞中的障礙,例如毒性和低轉(zhuǎn)染效率。

在納米技術(shù)的最新進(jìn)展中,作為最前沿的發(fā)現(xiàn)之一,Bozza等人開(kāi)發(fā)了一種非整合DNA納米載體,能夠生成在體外和體內(nèi)都具有活性的CAR-T細(xì)胞。該平臺(tái)不含病毒成分,能夠在分裂細(xì)胞的細(xì)胞核中進(jìn)行額外的染色體復(fù)制,在不需整合的情況下維持持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外,它還具有非病毒載體的所有優(yōu)點(diǎn):非免疫原性、簡(jiǎn)單、多功能且生產(chǎn)成本低廉。

新型生物材料

另一方面,通過(guò)使用開(kāi)發(fā)的新型生物材料來(lái)改善CAR-T細(xì)胞的分離、激活和基因修飾,正在取得進(jìn)展。一個(gè)例子是使用合成DNA適配體和互補(bǔ)逆轉(zhuǎn)技術(shù),允許從PBMC中分離出高純度和高產(chǎn)量的無(wú)標(biāo)記CD8+T細(xì)胞。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)具有不同特異性的適配體在單個(gè)分離步驟中分離多個(gè)不同的T細(xì)胞群。

基因編輯

基因編輯和靶向敲除分別依賴于宿主DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)和同源定向修復(fù)(HDR)過(guò)程,HDR通常在原代細(xì)胞中發(fā)生頻率較低,并且僅限于小的轉(zhuǎn)基因,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率較低。為了更高效地提供DNA插入,CRISPR/Cas9最近與轉(zhuǎn)座子結(jié)合,以提高RNA引導(dǎo)整合的效率,使用轉(zhuǎn)座酶催化整合。為此,有研究小組進(jìn)行了將CRISPR/Cas9與SB轉(zhuǎn)座子結(jié)合的實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,它們適用于未來(lái)的非病毒臨床應(yīng)用。識(shí)別和降低基因組重排和易位風(fēng)險(xiǎn)的方法可以允許在免疫治療中進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基因編輯的潛在臨床應(yīng)用。

小結(jié)

迄今為止,成功的CAR-T細(xì)胞治療都與用病毒載體工程化的T細(xì)胞有關(guān)。然而,復(fù)發(fā)、制造過(guò)程的復(fù)雜性以及這些技術(shù)在包括實(shí)體瘤在內(nèi)的其他疾病中的應(yīng)用,需要更復(fù)雜的設(shè)計(jì)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)適應(yīng)這些挑戰(zhàn)。為了填補(bǔ)這些空白,非病毒技術(shù)正在不斷取得進(jìn)展,可以肯定的是,未來(lái)很快就會(huì)看到它們?cè)贑AR-T細(xì)胞治療方面的更多應(yīng)用。

參考文獻(xiàn):

1.The Past, Present, and Future of Non-ViralCAR T Cells. Front Immunol.2022; 13: 867013.

       原文標(biāo)題 : 非病毒性CAR-T的過(guò)去、現(xiàn)在和未來(lái)

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