文章背景簡(jiǎn)介

植物木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是可持續(xù)發(fā)展的重要原料，可以應(yīng)用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料、生物能源等多種工業(yè)產(chǎn)品。其中農(nóng)業(yè)殘留物以及能源作物是最有希望的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)來(lái)源之一。然而目前所面臨的主要的挑戰(zhàn)在于植物細(xì)胞壁與生俱來(lái)的剛性和緊湊結(jié)構(gòu)對(duì)生物降解具有極大的阻礙，這是有效利用許多農(nóng)業(yè)廢物的一個(gè)主要障礙。每年都有大量沒(méi)有被家畜消化的農(nóng)業(yè)殘留物只能被通過(guò)焚燒或銷(xiāo)毀處理。而木聚糖酶作為一種水解酶，可以隨機(jī)分裂復(fù)雜植物細(xì)胞壁多糖木聚糖，通過(guò)酶預(yù)處理破壞植物細(xì)胞壁，可釋放木質(zhì)素和半纖維素成分、促進(jìn)消化降解過(guò)程。為了滿足行業(yè)需求，理想的木聚糖酶應(yīng)具有較高的比活性、良好的PH值和熱穩(wěn)定性。由于駱駝的飲食結(jié)構(gòu)主要由木質(zhì)灌木和樹(shù)木生物群落、各種鹽生植物和芳香植物物種組成，因此駱駝瘤胃微生物群落應(yīng)具有降解這些富含木質(zhì)纖維素和抗?fàn)I養(yǎng)因子難降解物質(zhì)的能力，從而被視為新型高效木聚糖酶的重要潛在來(lái)源。

2019年，伊朗農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所的Shohreh Ariaeenejad等人，在《Bioresource Technology》雜志（IF2017＝5．807；生物工程與應(yīng)用微生物2區(qū)）發(fā)表了題為“Mining of camel rumen metagenome to identify novel alkali－thermostable xylanase capable of enhancing the recalcitrant lignocellulosic biomass conversion”的文章。

所用到的主要方法

1．五階段計(jì)算篩選法：在尋找合適的侯選酶時(shí)，往往只通過(guò)生物方法是很難找尋到的。因此執(zhí)行了五個(gè)互補(bǔ)計(jì)算階段，來(lái)快速找尋侯選酶。主要步驟為階段一：將從元基因組中提取的酶列表與我們選定包含實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的酶列表進(jìn)行比對(duì)；階段二：研究候選序列在已知序列中的系統(tǒng)發(fā)育為止，剔除遠(yuǎn)親；階段三對(duì)前一階段剩余酶進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；階段四：研究前一階段剩余序列所選酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)；階段五：使用Expasy PROSITE軟件對(duì)剩余候選序列進(jìn)行活性位點(diǎn)分析。除PROSITE軟件外，主要涉及的軟件有應(yīng)用FASTQC對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)和驗(yàn)證。使用meta－velvet assembler從原始測(cè)序片段構(gòu)建contigs，以及使用MetaGeneMark軟件預(yù)測(cè)木聚糖酶基因。

2．PCR

3．SDS－PAGE

4．Bradford法測(cè)定蛋白濃度

5．DNS法測(cè)酶活

6．TLC薄層色譜法

7．AFM（原子力顯微鏡）分析：其原理為當(dāng)原子間距離減小到一定程度以后，原子間的作用力將迅速上升；因此，由顯微探針受力的大小就可以直接換算出樣品表面的高度，從而獲得樣品表面形貌的信息。AFM可以在大氣和液體環(huán)境下對(duì)各種材料和樣品進(jìn)行納米區(qū)域的物理性質(zhì)包括形貌進(jìn)行探測(cè)，或者直接進(jìn)行納米操縱；現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于半導(dǎo)體、納米功能材料、生物、化工、食品、醫(yī)藥研究和科研院所各種納米相關(guān)學(xué)科的研究實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域中，成為納米科學(xué)研究的基本工具。在觀測(cè)酶活生理過(guò)程中AFM是有力工具，同時(shí)還為酶活測(cè)定開(kāi)辟了新思路，是傳統(tǒng)酶活測(cè)定方法的有力補(bǔ)充。

文章主要內(nèi)容摘要

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)所產(chǎn)生的廢棄物中含有豐富的木聚糖和木素。除了不利的環(huán)境后果外，也將造成寶貴資源的浪費(fèi)。為了防止這些頑固不化的廢棄物造成生態(tài)失衡，并將其回收再利用，探索高效降解酶是一項(xiàng)嚴(yán)峻的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)需求。特別是能在極端溫度和pH條件下發(fā)揮活性的木聚糖酶?jìng)涫苋藗兊年P(guān)注，其中耐熱耐堿性木聚糖酶將有助于降低冷卻成本、提高反應(yīng)速度、延長(zhǎng)酶的半衰期、降低微生物污染和噬菌體感染的可能性，從而提高木質(zhì)纖維素基質(zhì)的溶解度和工業(yè)過(guò)程的催化效率，提高揮發(fā)性產(chǎn)品的回收率。這類(lèi)木聚糖酶是回收大量木聚糖和殘留的半纖維素廢物的關(guān)鍵因素。與其他研究環(huán)境相比，駱駝瘤胃微生物環(huán)境的一個(gè)顯著特征是瘤胃中纖維細(xì)菌種類(lèi)相對(duì)豐富，它們的豐富可能與駱駝的高木質(zhì)纖維素飲食有關(guān)。這些獨(dú)特的特性使駱駝瘤胃成為開(kāi)發(fā)這種新型酶的合適候選。而由于駱駝瘤胃微生物群中蘊(yùn)含的酶資源十分豐富，僅通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法就想要找到具有理想性質(zhì)的酶無(wú)異于大海撈針。該研究通過(guò)計(jì)算篩選鑒定了一種堿性耐熱木聚糖酶。除了基因預(yù)測(cè)和注釋步驟外，考慮blast結(jié)果、系統(tǒng)發(fā)育位置、預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸組成，并對(duì)其活性位點(diǎn)進(jìn)行分析，提出了一個(gè)五階段的步驟。經(jīng)鑒定、克隆純化、生物物理實(shí)驗(yàn)，最終證實(shí)該酶具有較強(qiáng)的堿熱穩(wěn)定性，并成功地應(yīng)用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的生物漂白和糖化。

木聚糖雙芽孢桿菌糖苷水解酶AxMan113A的結(jié)構(gòu)解析