題目:結(jié)直腸癌中腫瘤浸潤性CD8 + T細胞在早期與晚期的基因表達差異及預(yù)后不良的基因特征的鑒定

一、研究背景

細胞毒性CD8 + T細胞介導(dǎo)的反應(yīng)是適應(yīng)性免疫的最重要組成部分,它決定了宿主免疫反應(yīng)在消滅腫瘤細胞中的能力。由于腫瘤的內(nèi)在和/或外在因素,CD8 + TILs的密度和功能可能受到損害,導(dǎo)致不良的預(yù)后和生存。而CD8 + TILs水平升高與CRC患者的總體生存期延長和無復(fù)發(fā)生存期有關(guān),而與疾病階段無關(guān),這表明它們可能是預(yù)后改善的指標(biāo)。

二、研究流程

分階段步驟詳解:

三、結(jié)果解讀

1、早期與晚期階段的CRC TIL CD8+ T細胞轉(zhuǎn)錄組形成不同的聚類

根據(jù)疾病的階段將18例CRC患者CD8 + TIL樣本分為兩組:早期(E:I和II)和晚期(A:III和IV)階段,并分別進行RNA-Seq檢測,差異表達分析及基因功能注釋。

用火山圖表示基因在早期和晚期之間的差異表達,紅色為顯著上調(diào),綠色為下調(diào),灰色則為保持不變(圖1A)。

通過比較早期與晚期CRC患者的CD8 + TIL的轉(zhuǎn)錄組譜,并在基于DAVID網(wǎng)絡(luò)的工具中對顯著上調(diào)和下調(diào)的基因(倍數(shù)變化> 2和p <0．05)進行功能注釋,發(fā)現(xiàn)晚期患者CD8 + TILs中上調(diào)的基因與細胞趨化性、染色質(zhì)沉默、細胞缺氧反應(yīng)、Wnt信號傳導(dǎo)以及淋巴細胞增殖和凋亡過程的負調(diào)控途徑有關(guān);而下調(diào)的基因與T細胞共刺激、適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細胞因子分泌、IFN-γ信號傳導(dǎo)、細胞周期和DNA損傷檢查點途徑有關(guān)(圖1B)。

以熱圖的形式注釋了相關(guān)途徑中基因的表達情況(圖1C)。

檢查了與免疫細胞功能相關(guān)的特定基因的表達,并以火山圖和熱圖顯示了早期與晚期階段顯著上調(diào)和下調(diào)的基因及其表達情況(圖1D)。

2、CRC進展過程中穩(wěn)定失調(diào)基因的功能富集分析

接著分階段成對比較了I-IV期CRC患者的基因,并進行了差異表達分析(圖2A、B)。隨著疾病隨I–IV階段的發(fā)展,CRC TILs CD8 + T細胞基因的表達分階段遞增或遞減。

在DAVID中執(zhí)行了隨著疾病進展穩(wěn)步上調(diào)或下調(diào)的基因功能注釋(圖2C),并用熱圖顯示了根據(jù)功能注釋顯著上調(diào)或下調(diào)基因的Z score(圖2D)。

上調(diào)的基因(如HIST1H2AC,HIST1H2AB和HIST1H2AD)在染色質(zhì)沉默途徑中顯著富集,而下調(diào)的基因(如CCNE1,CCNB2等)在細胞周期和增殖途徑中顯著富集,或(如CXCL1,PF4等)在免疫應(yīng)答相關(guān)途徑的信號傳導(dǎo)和T小區(qū)共刺激中富集。

3、TCGA分析RNA-Seq數(shù)據(jù)顯示,CRC患者的CD8 + T細胞基因標(biāo)記不良

首先,使用35個上調(diào)的基因和59個下調(diào)的基因來計算“預(yù)后不良的CD8 + T細胞基因標(biāo)記(ppCD8sig)得分”,根據(jù)ppCD8sig得分將CRC TCGA病例標(biāo)記為高,中和低組。同時,在不同組別中比較了疾病特異性存活期(DSS)和無進展間隔期(PFI)的K-M曲線,并進行了Mantel-Cox檢驗。

 接著,使用了Cox比例風(fēng)險模型進行多變量分析,評估了DSS和PFI分別與預(yù)后指征ppCD8sig水平,疾病階段、是否殘存疾病、年齡、解剖位置和性別之間的關(guān)系。

 然后,用條形圖展示ppCD8sig評分高,中或低的患者在疾病各個階段的分布,并且探究不同ppCD8sig分數(shù)的患者與是否存在殘留疾病的關(guān)系。

與ppCD8sig得分中或低的患者相比,ppCD8sig得分高的患者疾病特異性生存期較差和無進展間隔期較短(圖3A、B)。

ppCD8sig可作為DSS和PFI的獨立預(yù)后指標(biāo) (P<0．05,圖3C、D) 。

在晚期階段(III和IV)的患者更可能具有高ppCD8sig得分(圖4E),同時,在主要治療后,患者的高ppCD8sig得分更可能有殘留疾病(圖4F)。

 總而言之,通過TCGA分析,從基因表達譜中鑒定出的基因標(biāo)記可以預(yù)測較差的生存期和更具侵略性的臨床病理特征,并且可以反映人CRC中CD8 + T細胞的水平。

4、高分預(yù)后不良CD8 + T細胞基因標(biāo)記與淋巴細胞增殖能力有限相關(guān)

基于Web工具,使用iDEP．91比較了9名ppCD8sig得分高與低的患者的CD8 + TIL轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)集,并且進行分層聚類和PCA分析。差異表達分析顯示,高ppCD8sig評分與低評分的患者相比,有1239個上調(diào)基因和862個下調(diào)基因 (圖5A) ;PCA則證實了這些生物復(fù)制品的親緣關(guān)系(圖5B)。

對數(shù)據(jù)集進行k-Means聚類分析,將差異表達基因分為兩個簇(A和B),通過Gene Ontology分析,發(fā)現(xiàn)簇A中上調(diào)的基因富含與翻譯起始和蛋白質(zhì)靶向相關(guān)的途徑,而簇B中下調(diào)的基因則富含與細胞周期,染色體分離,有絲分裂細胞周期和細胞分裂有關(guān)的途徑。

然后進一步比較了ppCD8Sig得分高或低患者的CD8 + TIL轉(zhuǎn)錄組, 用熱圖顯示了每個簇的基因表達情況(圖5C)。

5、ppCD8sig得分高的患者的腫瘤浸潤CD3 +和CD3 + CD8 + T細胞含量相對較低,IS也較低

首先,通過分析流式細胞儀數(shù)據(jù)并確定腫瘤浸潤CD3 +和CD3 + CD8 + T淋巴細胞的百分比,來確定T細胞浸潤的水平,  這可能反映了ppCD8sig得分高低與患者腫瘤組織中存在的免疫原性程度有關(guān)(圖6A),并且,t-SNE圖中顯示高ppCD8Sig得分的患者腫瘤組織中存在更少的CD3 + T細胞浸潤(圖6B)。

接著,用熱圖將基因表達的倍數(shù)變化表示為Z score,用散點圖將基因表達量表示為log 10 TPM,以比較ppCD8sig分數(shù)高低與患者CD8 + TIL中免疫檢查點基因和IFNG的表達的關(guān)系(圖6C),發(fā)現(xiàn),與ppCD8sig得分低的患者相比,得分高的患者mRNA表達水平除IFNG(IFN-)外,還顯示出較低的CTLA4,PDCD1(PD-1),HAVCR2(TIM-3)和TNFRSF9(4-1BB)。

然后,使用免疫組化確定了ppCD8sig得分高、低的患者的IS類別(圖6D),發(fā)現(xiàn)ppCD8sig得分低的9名患者中有6名表現(xiàn)出較高的IS(圖6E,以綠色顯示),而ppCD8sig得分高的9名患者中只有3名具有較高IS(圖6F,用綠色顯示)。根據(jù)ICs和IFN-γ的mRNA表達模式,所有ppCD8sig得分低的患者均表現(xiàn)出“熱”腫瘤(癌細胞的周圍聚集不少免疫細胞),ppCD8sig得分高的患者中大部分為“冷”腫瘤(癌細胞周圍只有很少的免疫細胞)。

這些數(shù)據(jù)表明,具有高ppCD8sig評分的患者CD3 +和CD3 + CD8 + TILs水平低,IS也較低,可以歸類為“冷”腫瘤。相反,低ppCD8sig評分具有較高的CD3 +和CD3 + CD8 + TIL水平,較高的IS和腫瘤,可歸類為“熱”腫瘤。這些數(shù)據(jù)進一步證實了所鑒定的基因標(biāo)記的預(yù)后價值,并可能突出其臨床相關(guān)性。

四、小結(jié)

小結(jié)

這篇學(xué)習(xí)筆記的研究思路較簡單,然后首先對18例CRC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)進行差異表達分析,分別依據(jù)疾病的發(fā)展階段或ppCD8sig得分劃分為不同組別進行比較及基因功能分析,然后使用多變量分析和Cox比例風(fēng)險模型評估ppCD8sig得分的預(yù)后意義,最后通過流式細胞儀和免疫染色評估ppCD8sig得分高和低的患者腫瘤中CD3 +和CD8 + T細胞浸潤的密度,證實了結(jié)直腸癌中所鑒定的ppCD8sig的預(yù)后價值。