由于有效載荷、連接子和偶聯(lián)方法的改進(jìn)，抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的發(fā)展在過(guò)去十年中取得了顯著進(jìn)展。特別是，連接子設(shè)計(jì)在調(diào)節(jié)ADC在體循環(huán)中的穩(wěn)定性和腫瘤中的有效載荷釋放效率方面起著關(guān)鍵作用，從而影響ADC的藥代動(dòng)力學(xué)（PK）、療效和毒性特征。

一些關(guān)鍵的連接子參數(shù)，如偶聯(lián)化學(xué)、連接子長(zhǎng)度和連接子空間位阻都會(huì)對(duì)ADC藥物的PK和功效產(chǎn)生影響。因此，在ADC藥物的設(shè)計(jì)中，正確調(diào)整連接子的這些重要參數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)ADC穩(wěn)定性和有效載荷釋放效率之間的平衡，才能達(dá)到ADC藥物預(yù)期的效果。

連接子設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)ADC穩(wěn)定性

ADC在體循環(huán)和組織細(xì)胞中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，除了抗體代謝和分解代謝外，連接子去偶聯(lián)、連接子降解和有效載荷代謝被認(rèn)為是典型的主要生物轉(zhuǎn)化途徑。

理想情況下，ADC希望在進(jìn)入靶細(xì)胞之前在循環(huán)中保持完整和穩(wěn)定，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多涉及偶聯(lián)位點(diǎn)選擇和連接子修飾的方法來(lái)增強(qiáng)ADC穩(wěn)定性。通常，可以出于這種目的對(duì)每個(gè)組件（包括抗體、連接子和有效載荷）進(jìn)行修改，然而研究表明，調(diào)節(jié)偶聯(lián)位點(diǎn)、連接子長(zhǎng)度和連接子空間位阻是更有效的通用方法。

通過(guò)選擇更具空間位阻的偶聯(lián)或附著位點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)由抗體提供的空間屏蔽。另一方面，已經(jīng)證明，在連接子上引入近端空間位阻的替代化學(xué)修飾是提高穩(wěn)定性的有效方法。抗體提供的空間屏蔽有助于減少連接子裂解以及有效載荷代謝。例如，位點(diǎn)HC－A118、LC－K149和HC－A140提供了增強(qiáng)的ADC穩(wěn)定性，降低了部分溶劑可及性（FSA），對(duì)應(yīng)于偶聯(lián)位點(diǎn)周圍增加的空間屏蔽。

在此基礎(chǔ)上，通過(guò)改變另一個(gè)主要因素，即連接子長(zhǎng)度，可以通過(guò)抗體和有效載荷之間的距離對(duì)空間屏蔽的影響來(lái)調(diào)節(jié)ADC穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，較短的連接子相對(duì)于較長(zhǎng)的連接子，通過(guò)將有效載荷進(jìn)一步固定在抗體的空間屏蔽內(nèi)，通常會(huì)導(dǎo)致更好的ADC穩(wěn)定性。

此外，偶聯(lián)化學(xué)也是影響ADC穩(wěn)定性的重要因素，馬來(lái)酰亞胺和二硫鍵代表兩種主要類型的偶聯(lián)化學(xué)。馬來(lái)酰亞胺已被廣泛用作抗體偶聯(lián)方式，并與可切割或不可切割的連接子一起使用。因此，根據(jù)有效載荷的作用機(jī)制，藥理有效成分可以是有效載荷本身或具有部分或全長(zhǎng)連接子的有效載荷。對(duì)于可切割或不可切割的連接子，有效釋放活性成分可以通過(guò)最佳連接子設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)。基于二硫鍵的抗體偶聯(lián)最近被開(kāi)發(fā)為一種生成可切割連接子的新策略。對(duì)于馬來(lái)酰亞胺和二硫鍵可裂解的連接子而言，裂解位點(diǎn)附近產(chǎn)生的空間位阻非常關(guān)鍵，可以通過(guò)化學(xué)修飾來(lái)調(diào)節(jié)偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。

連接子設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)ADC有效載荷釋放

有效載荷釋放可能是ADC內(nèi)化到細(xì)胞后的限速步驟。對(duì)于不可切割的連接子，在溶酶體中，抗體被蛋白酶分解或水解為肽或氨基酸（AA）。在這些情況下，產(chǎn)生生物活性分解代謝產(chǎn)物，其中有效載荷在其結(jié)構(gòu)中保留某種類型的肽或AA，有效載荷溶酶體釋放可能需要一種轉(zhuǎn)運(yùn)體。相反，可切割連接子被設(shè)計(jì)通過(guò)酶或化學(xué)方式，在連接基團(tuán)斷裂后自降解，以釋放附著的有效載荷。因此，在這些情況下，有效載荷釋放的速率取決于連接子裂解和隨后的固定步驟。

在相同的連接子化學(xué)條件下，結(jié)合位點(diǎn)會(huì)影響有效載荷釋放的動(dòng)力學(xué)。例如，對(duì)于連接到LC－V205、HC－A118、HC－A140和LC－K149位點(diǎn)的連接子，觀察到一系列從快到慢的有效載荷釋放動(dòng)力學(xué)。特別是，HC－A118C位點(diǎn)的吡咯［2，1－c］苯二氮卓二聚體（PBD）有效載荷釋放（15分鐘）比LC－K149C位點(diǎn)（60分鐘）快。

結(jié)合位點(diǎn)直接影響釋放動(dòng)力學(xué)，與單克隆抗體無(wú)關(guān)。在裂解位點(diǎn)引入空間位阻的化學(xué)修飾有助于提高ADC穩(wěn)定性。此外，空間位阻也可能導(dǎo)致有效載荷的緩慢或無(wú)效釋放。一個(gè)很好的例子是環(huán)丁基與環(huán)丙基二硫化物連接子之間的比較，環(huán)丁基類似物對(duì)小鼠有效，而環(huán)丙基類似物對(duì)小鼠無(wú)效。深入研究表明，含有環(huán)丁基的分子能夠有效釋放活性PBD二聚體，然而，在環(huán)丙基類似物中未觀察到二硫鍵連接子斷裂后的自降解，因此，有效載荷并沒(méi)有得到有效釋放發(fā)揮生物活性。

連接子集成設(shè)計(jì)獲得最佳療效

總體而言，想要獲得最佳的ADC需要集成連接子的設(shè)計(jì)方法。如前所述，這種方法應(yīng)包括多個(gè)參數(shù)，包括偶聯(lián)位點(diǎn)、連接子長(zhǎng)度、連接子化學(xué)、可切割／不可切割連接和近端連接空間位阻。

如上圖所示，相對(duì)穩(wěn)定性排名為A1? A2＜A3? A4 aHER2－ss－PBDTDC。特別是，與S－S二硫鍵兩側(cè)的H相比，CH3增強(qiáng)的空間位阻提高了ADC穩(wěn)定性：A1＜A3（LC－K149C），A2＜A4（HC－A140C）。A4是最穩(wěn)定的PBD－TDC，但在小鼠異種移植模型中，其活性最低�？傮w療效排名順序?yàn)锳4＜A1＜A3／A2。另一方面，腫瘤中釋放的PBD二聚體濃度的排名與觀察到的療效趨勢(shì)大致一致（A4＜A1＜A3＜A2）。

此外，在同一偶聯(lián)位點(diǎn)LC－K149C處，aCD22單甲基auristatin E（MMAE）的TDC穩(wěn)定性在不同的連接子（B1－B3的S－S與B4的馬來(lái)酰亞胺）之間相似。然而，當(dāng)B4／B2達(dá)到100％腫瘤生長(zhǎng)抑制（TGI）時(shí)，觀察到顯著不同的活性（B1＜B3＜B4／B2），同樣與腫瘤內(nèi)釋放的MMAE濃度（B1＜B3＜B4＜B2）一致。

上圖為一系列aCD22 ss maytansine（DMx）TDC，分別在LC－K149C（C1－C6）和S400C（C7－C8）位置對(duì)二硫化物連接子進(jìn)行了不同的化學(xué)修飾。療效排名（C3＜C4／C5／C8＜C1／C7／C2／C6），與腫瘤中測(cè)得的DMx濃度（C3＜C4／C5／C8＜C1＜C7＜C2＜C6）一致，其中C1／C7／C2／C6達(dá)到100％TGI。因此，最終有效載荷釋放是ADC循環(huán)穩(wěn)定性和有效載荷釋放動(dòng)力學(xué)的順序累積結(jié)果。

在三組TDC類似物中，盡管腫瘤內(nèi)有效載荷濃度不同，PBD－A3／A2、MMAE－B4／B2、DMx－C1／C7／C2／C6 TDC觀察到完全TGI。與之前的aHER2 MMAE TDC相比，TDC A－C的功效與血漿中的穩(wěn)定性、DAR或總抗體（Tab）暴露無(wú)關(guān)�？鼓[瘤療效與腫瘤內(nèi)有效載荷暴露相關(guān)，具有“平臺(tái)”效應(yīng)。。因此，以達(dá)到預(yù)期療效所需的最低閾值水平的方式向腫瘤提供有效載荷非常重要。

因此，連接子的設(shè)計(jì)應(yīng)該優(yōu)化，以達(dá)到ADC穩(wěn)定性和有效載荷釋放動(dòng)力學(xué)之間的平衡，從而在腫瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效載荷的釋放高于療效閾值。腫瘤有效載荷濃度評(píng)估可用于預(yù)測(cè)ADC在臨床前模型中的療效。

連接子集成設(shè)計(jì)結(jié)合劑量方案設(shè)計(jì)

較高的ADC劑量并不總是有助于提高療效，一旦達(dá)到關(guān)鍵閾值，可能只會(huì)增加潛在毒性。因此，需要綜合連接子設(shè)計(jì)與劑量方案設(shè)計(jì)，以找到最小有效劑量。

以上圖為例，TDC aHER2－HC－A118C－Me－SS－PBD在靜脈注射1×1mg／kg劑量時(shí)達(dá)到完全TGI；而在MMTV－HER2／Fo5小鼠中，超過(guò)3周的3×0．33 mg／kg（每周）方案未能達(dá)到完全的腫瘤抑制終點(diǎn)。當(dāng)在BJAB小鼠中測(cè)試時(shí)，相比3×0．5 mg／kg 的劑量，TDC aCD22－LC－K149C－vc－PAB－MMAE在1×1．5 mg／kg時(shí)表現(xiàn)出更好的活性，同樣，在1×3 mg／kg和3×1 mg／kg劑量持續(xù)7周以上時(shí)顯示出相似的療效。

另一項(xiàng)試驗(yàn)，TDC aCD22－LC－K149C－MCC－DM1分3個(gè)劑量組進(jìn)行，分別采用3種劑量方案：1．5mg／kg總劑量（3×0．5 mg／kg，2×0．7mg／kg，1×1．5 mg／kg），3 mg／kg總劑量（3×1 mg／kg，2×1．5 mg／kg，1×3 mg／kg），6 mg／kg總劑量（2×3 mg／kg，2×3 mg／kg）。盡管所有受試劑量方案均顯示出一定的活性，但較大的每日總劑量組產(chǎn)生了更好的腫瘤抑制作用。此外，在每個(gè)劑量組中，單劑量顯示出最佳療效，表明有效載荷Cmax對(duì)腫瘤的驅(qū)動(dòng)效應(yīng)。在這種情況下，當(dāng)達(dá)到完全TGI和比其他相應(yīng)的分?jǐn)?shù)劑量方案更好的腫瘤抑制時(shí)，單劑量可作為療效的閾值劑量。在單劑量和多劑量部分方案產(chǎn)生相似療效的情況下，可根據(jù)提供足夠而不過(guò)量有效載荷的原則選擇最小有效劑量，以獲得最佳療效曲線和最小毒性。。

小結(jié)

ADC的發(fā)展在過(guò)去十年中取得了快速的進(jìn)步，而為了獲得最佳療效的ADC，應(yīng)考慮采用連接子集成設(shè)計(jì)的方法�？刹捎玫闹匾獏�數(shù)包括偶聯(lián)位點(diǎn)、偶聯(lián)化學(xué)、連接子長(zhǎng)度、可切割／不可切割連接以及局部連接空間位阻。需要解決的關(guān)鍵點(diǎn)是在ADC穩(wěn)定性和有效載荷釋放之間實(shí)現(xiàn)平衡，以獲得最佳的腫瘤內(nèi)有效載荷PK曲線和療效。此外，建議將集成連接子設(shè)計(jì)與劑量設(shè)計(jì)相結(jié)合，以找到理想療效和最小毒性的最佳劑量方案。

參考文獻(xiàn)：

1．Linker Design Impacts Antibody－DrugConjugate Pharmacokinetics and Efficacy via Modulating the Stability and Payload Release Efficiency． Front Pharmacol． 2021； 12： 687926．