近年來，自然殺傷（NK）細(xì)胞的CAR工程化由于NK細(xì)胞獨(dú)特的生物學(xué)特性而獲得了相當(dāng)大的發(fā)展，使其成為腫瘤免疫治療中極具吸引力的領(lǐng)域。NK細(xì)胞，即使通過基因工程表達(dá)CAR分子，仍保留其通過自身受體識(shí)別腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在能力，此外NK細(xì)胞不依賴T細(xì)胞受體（TCR）進(jìn)行細(xì)胞毒性殺傷。這使它們與CAR－T細(xì)胞相比具有更有利的安全性。

在過去幾年中，關(guān)于CAR－NK細(xì)胞產(chǎn)品的臨床研究出現(xiàn)了前所未有的加速。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，研究人員使用不同來源的NK細(xì)胞和各種模塊化的CAR設(shè)計(jì)，針對(duì)多種靶抗原�？偟膩碚f，有兩個(gè)主要趨勢(shì)：首先目標(biāo)疾病的范圍發(fā)生了變化，雖然早期的大多數(shù)試驗(yàn)集中于血液系統(tǒng)惡性腫瘤，但最近許多的試驗(yàn)開始尋求探索CAR－NK細(xì)胞免疫療法在治療實(shí)體瘤方面的功效。第二，越來越多CAR－NK通過多重基因編輯方法去實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以增強(qiáng)NK細(xì)胞的效力和持久性，新一代的CAR－NK已暫露雛形。

更合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

除了將CAR－NK細(xì)胞重新定向到不同的靶抗原外，最近的研究重點(diǎn)已越來越轉(zhuǎn)向基于不同跨膜和細(xì)胞內(nèi)共刺激域的模塊化組合的優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以增強(qiáng)CAR－NK的效力。

如今，研究人員利用現(xiàn)有的多種基因工程能力，對(duì)CAR結(jié)構(gòu)進(jìn)行微調(diào)，以誘導(dǎo)更有效的抗腫瘤反應(yīng)，增加抗原親和力或延長(zhǎng)體內(nèi)持久性。已經(jīng)研究了多種共刺激元件，包括來源于免疫球蛋白超家族（CD28、ICOS）、TNF受體超家族（4－1BB、CD27、OX40和CD40）以及其他包括CD40L和toll樣受體（TLR）的結(jié)構(gòu)域。與一些早期主要基于參與T細(xì)胞活化的共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR－NK結(jié)構(gòu)相比，NK細(xì)胞特異性信號(hào)適配器的價(jià)值越來越高，DAP10、DAP12和2B4的作用尤為突出。

在一項(xiàng)研究CD19導(dǎo)向的CAR－NK的臨床前研究中，加入DAP10（NKG2D的生理適配器）比單獨(dú)使用CD3ζ信號(hào)的構(gòu)建物增強(qiáng)了抗腫瘤效力。類似的，在其它研究中報(bào)道了通過將DAP12加入前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）靶向的CAR結(jié)構(gòu)，以及將2B4加入間皮素靶向的CAR－NK細(xì)胞，結(jié)果均具有放大的抗腫瘤效力。

武裝CAR

前三代CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的調(diào)整均依賴于生理上發(fā)生的免疫細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域。而被稱為武裝CAR的第四代結(jié)構(gòu)采用了一種截然不同的方法，通過加入分子有效載荷，從而賦予CAR修飾的免疫細(xì)胞在任何生理免疫細(xì)胞受體中都找不到的額外特征和功能。這種方法使CAR結(jié)構(gòu)能夠被工程化，以解決細(xì)胞免疫治療的一些固有生物學(xué)局限。                      

借助現(xiàn)代雙順反子和多順反子載體平臺(tái)，第四代CAR結(jié)構(gòu)可以包含多個(gè)理想的基因修飾。目前最緊迫的生物學(xué)限制是在缺乏外源性細(xì)胞因子支持的情況下，體內(nèi)持久性的問題。通過添加結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)基因IL－15細(xì)胞因子，可以保持CAR－NK在體內(nèi)的持續(xù)存在并增強(qiáng)抗腫瘤療效。另外，通過添加可誘導(dǎo)的半胱天冬酶9（iCasp9）的分子安全開關(guān)，可以清除所有循環(huán)中的過繼NK細(xì)胞，以防出現(xiàn)不良毒性。

CAR－NK免疫檢查點(diǎn)的修飾

盡管過繼性NK細(xì)胞治療取得了顯著的成功，但免疫細(xì)胞耗竭仍然是一個(gè)治療障礙。為了構(gòu)建下一代的CAR－NK，NK細(xì)胞基礎(chǔ)生物學(xué)也正在努力，以確定NK細(xì)胞免疫功能的負(fù)調(diào)節(jié)因子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些檢查點(diǎn)受體如PD－1、LAG－3、TIM－3、TIGIT以及KLRG1在耗竭的NK細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。

NKG2A是最顯著的抑制性NK細(xì)胞受體之一，它的基因缺失與NK細(xì)胞針對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒性增加有關(guān)，阻斷TIGIT也被證明可以防止NK細(xì)胞耗竭。此外，通過添加含細(xì)胞因子可誘導(dǎo)SH2蛋白（CIS），這是IL－15信號(hào)上游的一個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞因子檢查點(diǎn)，在CAR－NK細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)的代謝適應(yīng)度和效應(yīng)器功能。其他研究還包括PD－1／PD－L1和CTLA－4阻斷對(duì)NK細(xì)胞的影響。

促進(jìn)CAR－NK細(xì)胞的靶向性

為了實(shí)現(xiàn)更好的抗實(shí)體瘤效果，下一代CAR－NK需要進(jìn)行工程設(shè)計(jì)，以增強(qiáng)向腫瘤的遷移和穿透能力。一些研究正在加強(qiáng)NK細(xì)胞趨化因子受體的基因修飾，以使NK更有效地歸巢到腫瘤部位。在腎細(xì)胞癌中，經(jīng)修飾表達(dá)CXCR2的NK細(xì)胞表現(xiàn)出向疾病部位轉(zhuǎn)運(yùn)的改善。類似地，在EGFRvIII靶向的CAR－NK細(xì)胞上強(qiáng)制表達(dá)CXCR4可提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型的存活率。

實(shí)體瘤的特點(diǎn)是具有高度的異質(zhì)性，每個(gè)克隆都有其獨(dú)特的免疫表型和抗原表達(dá)模式，單一抗原導(dǎo)向的細(xì)胞療法往往面臨巨大障礙，雙特異性和多特異性靶向已經(jīng)成為解決異質(zhì)性帶來挑戰(zhàn)的一個(gè)有前途的方向。

一些研究已經(jīng)在探索雙靶點(diǎn)CAR－NK的應(yīng)用，如對(duì)野生型EGFR和EGFRvIII都具有特異性的NK－92衍生的CAR－NK細(xì)胞。當(dāng)異種移植模型中，雙靶向CAR－NK細(xì)胞有效地抑制了腫瘤生長(zhǎng)，提高了生存率，而與EGRF突變狀態(tài)無關(guān)。另外，一種多特異性B7－H3靶向iPSC衍生的CAR－NK可識(shí)別多種實(shí)體瘤。

改善免疫抑制腫瘤微環(huán)境

除了NK固有免疫檢查點(diǎn)外，還有一些由腫瘤微環(huán)境引起的外在因素，為浸潤(rùn)免疫細(xì)胞創(chuàng)造了非常不利的環(huán)境。這些因素包括營(yíng)養(yǎng)缺乏、酸度和缺氧的綜合作用，以及免疫抑制細(xì)胞和免疫抑制因子的影響。

免疫抑制代謝物腺苷已知通過阻斷NK細(xì)胞表面A2A腺苷受體（A2AR）影響NK細(xì)胞功能。A2AR敲除的NK細(xì)胞在BRAF突變黑色素瘤的異種移植小鼠模型中顯示出增強(qiáng)的腫瘤控制作用。此外，通過使用CRISPR／Cas9靶向編輯TGFBR2基因，成功地使原代人類NK細(xì)胞對(duì)免疫抑制性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF－β）產(chǎn)生拮抗。

調(diào)節(jié)CAR－NK代謝

目前，針對(duì)免疫代謝途徑已成為一個(gè)有趣的概念，以使NK細(xì)胞更具代謝活力并保持其功能能力。在NK細(xì)胞中，IFN－γ的產(chǎn)生依賴于葡萄糖驅(qū)動(dòng)的氧化磷酸化。一旦激活，NK細(xì)胞就會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性的代謝變化，從而增加糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）的速率，以支持產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需的能量。

雷帕霉素復(fù)合物1 （mTORC1）在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞代謝中起著關(guān)鍵作用，研究表明，CISH信號(hào)的破壞產(chǎn)生對(duì)CAR－NK細(xì)胞的代謝重組，從而保持升高的mTORC1和MYC活性，促進(jìn)體內(nèi)持久性和增強(qiáng)抗腫瘤活性。

在轉(zhuǎn)錄水平上，甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）和MYC已被確定為協(xié)調(diào)代謝適應(yīng)的兩個(gè)中央調(diào)節(jié)元件，使活化的NK細(xì)胞能夠有效地啟動(dòng)免疫應(yīng)答。MYC信號(hào)通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶的表達(dá)以及增加有絲分裂，使代謝機(jī)制適應(yīng)NK細(xì)胞的特定需求。NK細(xì)胞中維持細(xì)胞內(nèi)MYC蛋白水平的一種機(jī)制是通過糖原合成酶激酶3（GSK3）介導(dǎo)的磷酸化以及隨后的泛素化和蛋白酶體降解，研究發(fā)現(xiàn)，GSK3的抑制可穩(wěn)定NK細(xì)胞中的MYC水平，從而提高其抗腫瘤效力。

小結(jié)

許多利用高度創(chuàng)新的下一代基因工程方法的CAR－NK細(xì)胞療法正在探索中，以應(yīng)對(duì)實(shí)體瘤的獨(dú)特挑戰(zhàn)，它們有望在短期內(nèi)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。支持這些發(fā)展的是對(duì)基礎(chǔ)免疫細(xì)胞生物學(xué)的日益增長(zhǎng)的理解，強(qiáng)大的多功能組學(xué)和單細(xì)胞分析技術(shù)越來越多地推動(dòng)了我們?cè)谶@方面的認(rèn)識(shí)。隨著基因工程能力的強(qiáng)大進(jìn)步，這些見解將推動(dòng)進(jìn)一步的治療創(chuàng)新，并隨著時(shí)間的推移，從根本上改變當(dāng)前的治療模式，顯著改善臨床結(jié)果，造福于更多的癌癥患者。

參考文獻(xiàn)：

1．Engineering the next generation of CAR－NKimmunotherapies． Int J Hematol． 2021 Aug 28 ： 1–18．