前言

blinatumomab在治療復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病方面的成功，使基于雙特異性抗體的T細(xì)胞導(dǎo)向療法成為腫瘤免疫治療藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。

這種分子結(jié)構(gòu)是通過與T細(xì)胞上的CD3和癌細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的相互作用來連接T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。通過繞過MHC／TCR識別，這種方法能夠在沒有克隆限制的情況下誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，并克服因?yàn)镸HC表達(dá)下調(diào)產(chǎn)生的腫瘤免疫逃逸。

近年來，隨著雙抗表達(dá)和純化技術(shù)的不斷突破，雙抗已經(jīng)發(fā)展出近70種結(jié)構(gòu)，而不同的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的抗原識別臂距離。鑒于幾何構(gòu)型可能在形成免疫突觸中起關(guān)鍵作用，通過構(gòu)建兩種不同形式的雙特異性抗體模式：diabody FC（DbFc）和基于IgG的分子模式，研究發(fā)現(xiàn)擁有更長結(jié)合臂的IgG分子結(jié)構(gòu)對膜近端的抗原表位更有效，而擁有較短結(jié)合臂的DbFc對對膜遠(yuǎn)端的抗原表位更有效。

雙抗形式取決于作用目的

隨著重組蛋白表達(dá)技術(shù)和抗體工程技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了許多不同的抗體形式。最佳的抗體結(jié)構(gòu)取決于所期望的生物效應(yīng)及其潛在的結(jié)構(gòu)條件。多特異性抗體用于各種目的，包括受體激活、阻斷、內(nèi)化、聚集、膜相關(guān)蛋白的結(jié)合或細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞的定向靶點(diǎn)。

人工免疫突觸的結(jié)構(gòu)特征

抗原呈遞細(xì)胞（APC）與T細(xì)胞之間的生理免疫突觸（IS）是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵。在T細(xì)胞膜上，IS顯示為一個(gè)嵌套的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，常被稱為“bullseye”。中心區(qū)cSMAC（中央超分子激活簇）包含諸如T細(xì)胞受體（TCR）復(fù)合物、共刺激分子CD28、抑制免疫檢查點(diǎn)（如PD－1或CTLA－4）、信號介質(zhì)如Lck（淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶）和PKC（蛋白激酶C），以及穿孔素等細(xì)胞毒性分子。

cSMAC被周圍的SMAC（pSMAC）包圍，其中包含許多粘附分子，它們介導(dǎo)細(xì)胞－細(xì)胞的結(jié)合（如LFA1）。遠(yuǎn)端環(huán)（dSMAC）包括抑制性酪氨酸磷酸酶CD45和動態(tài)肌動蛋白。APC和T細(xì)胞之間的膜距離約為13–15nm。試驗(yàn)表明，一個(gè)拉長的膜間距降低了T細(xì)胞的活化，說明較近的距離是必須的，以適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)T細(xì)胞活化。眾所周知，BsAb通過同時(shí)結(jié)合靶細(xì)胞上的TCR亞單位CD3ε和TAA來促進(jìn)規(guī)則的細(xì)胞溶解免疫突觸的形成。人工免疫突觸是一個(gè)高度組織化的結(jié)構(gòu)，與生理拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有相同的特征。腫瘤和T細(xì)胞之間的膜間距非常重要，因此，抗體尺寸是突觸形成的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。短結(jié)合臂對膜遠(yuǎn)端抗原更有效

為了比較不同雙抗形式的結(jié)合臂與形成人工免疫突觸誘導(dǎo)T細(xì)胞活化能力之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計(jì)了一種新的雙特異性diabody Fc（DbFc）格式，它采用了更緊湊的構(gòu)型。與的基于IgG的分子形式相比，兩個(gè)抗原識別臂之間的距離估計(jì)分別為3–6 nm和9–15 nm。

此外，為了系統(tǒng)地研究抗原表位位置在T細(xì)胞導(dǎo)向療法中的作用，實(shí)驗(yàn)人員通過將表皮生長因子（EGF）樣結(jié)構(gòu)域作為相對剛性的結(jié)構(gòu)間隔物，設(shè)計(jì)了一系列表達(dá)BCMA抗原的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系以不同的EGF樣結(jié)構(gòu)域作為系鏈，以增加到靶細(xì)胞膜的距離。

研究發(fā)現(xiàn)，在24小時(shí)的效應(yīng)器靶標(biāo)比（E：T比）為5：1時(shí)，所有三種分子在誘導(dǎo)T0細(xì)胞系裂解方面表現(xiàn)出幾乎相等的活性，T0細(xì)胞系在細(xì)胞表面呈現(xiàn)BCMA而沒有任何栓系。隨著到細(xì)胞表面的距離隨著EGF樣結(jié)構(gòu)域數(shù)量的增加而增加，雙特異性IgG2誘導(dǎo)T細(xì)胞定向裂解的能力迅速減弱，而Db和DbFc在細(xì)胞系T0到T5中顯示出相當(dāng)強(qiáng)的細(xì)胞毒性，T6和T7中的效力顯著降低。

這說明雙特異性抗體分子使T細(xì)胞與靶細(xì)胞接近的程度對免疫突觸形成的效率有重要影響。全長IgG和Db衍生分子的差異可以用兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的臂距來解釋，因?yàn)镈b和DbFc結(jié)構(gòu)更為堅(jiān)硬和緊湊，導(dǎo)致T細(xì)胞和抗原表達(dá)細(xì)胞之間的距離相對較短，當(dāng)超過T細(xì)胞活化的距離閾值時(shí)，雙抗的殺傷功能就會明顯下降。

長結(jié)合臂對膜近端抗原更有效

然后實(shí)驗(yàn)人員檢查了相反的情況，抗原表位位于膜的近端區(qū)域，并被其上不同數(shù)量的結(jié)構(gòu)單元所掩蓋。

于沒有任何掩蔽的M0v細(xì)胞系，兩種分子在15小時(shí)和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)顯示出幾乎不可區(qū)分的EC50和Emax，24小時(shí)的數(shù)據(jù)清楚地顯示出更高的最大殺傷率和顯著的左移EC50。對于M2v和M4v，在15小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，DbFc活性明顯低于基于IgG的分子。

然而，這兩種分子的劑量－效應(yīng)曲線在24小時(shí)時(shí)趨于一致，這個(gè)結(jié)果可能是由于T細(xì)胞活化的動力學(xué)差異導(dǎo)致，在足夠長的時(shí)間內(nèi)，EGF樣結(jié)構(gòu)域可能具有一定的結(jié)構(gòu)靈活性，允許暴露膜近端BCMA抗原。對于M7v細(xì)胞系，即使在24小時(shí)，DbFc的Emax也穩(wěn)定在約50％，低于基于IgG的分子，這表明在這種情況下，即使是柔韌性也不能克服空間位阻來補(bǔ)償DbFc橋接CD3和BCMA的低概率。

靶向不同表位的雙抗與體外活性的關(guān)系

為了深入了解表位位置如何影響雙抗的細(xì)胞殺傷活性，實(shí)驗(yàn)人員在過度表達(dá)FLT3的EoL1急性髓系白血�。ˋML）細(xì)胞系上設(shè)計(jì)并研究了多種FLT3／ CD3雙特異性抗體分子。FLT3是一種受體酪氨酸激酶，其胞外結(jié)構(gòu)域由五個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域組成。

結(jié)果顯示，與一系列表達(dá)BCMA的工程細(xì)胞系的研究結(jié)果一致，針對FLT3不同結(jié)構(gòu)域的雙特異性分子顯示出顯著不同的細(xì)胞毒性，其受到分子形式的強(qiáng)烈影響。靶向膜遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域D1和D3的DbFc介導(dǎo)了比其IgG對應(yīng)分子更有效的細(xì)胞毒性，可能是由于其使兩個(gè)細(xì)胞膜緊密結(jié)合的能力。

另一方面，針對膜近端結(jié)構(gòu)域D4和D5的IgG雙特異性分子誘導(dǎo)特異性靶細(xì)胞裂解，而對于DbFc形式的相同抗FLT3抗體，在高達(dá)10 nM的濃度下未觀察到顯著的細(xì)胞毒性。

小結(jié)

通過使用兩種形式（基于IgG和DbFc）的雙抗，對抗原表位位置和雙抗分子激活T細(xì)胞的體外效力之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗原表位位于膜遠(yuǎn)端區(qū)域時(shí)，DbFc形式更有效，而基于IgG的雙特異性分子對于被其他結(jié)構(gòu)域掩蓋的膜近端表位更有效。

此外，在更具生物學(xué)相關(guān)性的背景下，針對FTL3抗原不同結(jié)構(gòu)域的雙特異性分子證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。因此，在設(shè)計(jì)T細(xì)胞導(dǎo)向療法的雙抗分子時(shí)，除了考慮抗體的親和力，分子形式，抗原特性之外，還需要注意不同雙抗形式與抗原結(jié)合表位位置的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

1． One size does not fit all： navigating the multi－dimensional spaceto optimize T－cell engaging protein therapeutics． MAbs． 2021； 13（1）： 1871171．

2． Format and geometries matter： Structure－based design defines the functionalityof bispecific antibodies． Comput Struct Biotechnol J． 2020 May14；18：1221－1227．