前言

抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）在過去10年中取得了長足的進展，ADC是一種通過一個合理構(gòu)建的連接子將細胞毒性小分子藥物偶聯(lián)到單克隆抗體上的復(fù)合物，可以向腫瘤內(nèi)選擇性地輸送有效的細胞毒性藥物。

2009 年gemtuzumab ozogamicin （Mylotarg） 是美國食品和藥物管理 局（FDA）批準的第一個 ADC 藥物。目前，F(xiàn)DA 已經(jīng)批準上市了 11 個 ADC藥物，還有上百個 ADC 藥物正處于臨床研究階段。

ADC對于藥物靶點的選擇，除了首先要在腫瘤過度表達外，這些抗原的另一個重要因素是內(nèi)吞的效率，這是藥物釋放活性所必需的。事實上，ADC的療效取決于靶向介導(dǎo)的內(nèi)化在腫瘤細胞內(nèi)傳遞有效載荷的效率。

ADC內(nèi)化的途徑和效率，也與ADC藥物的療效和設(shè)計息息相關(guān)。因為它是連接子選擇可切割、不可切割或pH／還原敏感型的重要因素，以及有效載荷（或其活性代謝物）是否能夠在細胞膜上擴散以提供“旁觀者效應(yīng)”，還有是否提高了腫瘤殺傷率或有助于劑量限制毒性。因此有必要深入了解ADC的內(nèi)吞作用和機制，因為它是ADC在體內(nèi)發(fā)揮藥效中極其重要的第一步。

ADC的相關(guān)內(nèi)吞途徑

一般來說，正常的內(nèi)吞作用可分為三個階段：（1）芽的形成，（2）膜的彎曲和囊泡的成熟，（3）膜的斷裂并釋放到細胞質(zhì)中。多種內(nèi)吞途徑有重疊的方面，因此內(nèi)吞的一般過程是高度靈活和復(fù)雜的。

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）在概念上是一個簡單的過程，包括幾個連續(xù)和部分重疊的步驟。CME可由質(zhì)膜上的某些受體結(jié)構(gòu)性啟動，或者需要配體和／或抗體結(jié)合后啟動。當(dāng)細胞質(zhì)中的內(nèi)吞衣殼蛋白開始聚集在質(zhì)膜的內(nèi)小葉上時，CME就開始了。衣殼蛋白通過從細胞質(zhì)中招募并與額外的蛋白質(zhì)適配器相互作用而繼續(xù)組裝和生長。關(guān)鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內(nèi)化受體／配體集中到一個“網(wǎng)格蛋白包被坑”（CCP）中。由于CCP內(nèi)陷增大，CCP頸縮窄時，通過一個斷裂過程與質(zhì)膜分離。肌動蛋白聚合有助于將CCP向內(nèi)拉入細胞質(zhì)，直到斷裂完成，CCP釋放并成為一個網(wǎng)格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV外殼被分解，CCV與內(nèi)涵體融合以運輸?shù)教囟ǖ膩喖毎�位置，或者可以被回收回細胞表面�?/p>

網(wǎng)格蛋白是CME的關(guān)鍵成分，由重鏈和輕鏈組成。三個網(wǎng)格蛋白重鏈和輕鏈形成一個三聚體，它與其他三聚體相互作用，并在新興的CCP周圍形成一個多邊形晶格。銜接蛋白2（AP－2）是一種異源四聚體復(fù)合物，它介導(dǎo)CCP頸部的收縮。Dynamin是一種GTP酶，在成熟囊泡的頸部形成螺旋狀聚合物。GTP水解后，dynamin誘導(dǎo)囊泡從質(zhì)膜分裂。

小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

不依賴于網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用包括小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白／GPI－富集的早期內(nèi)區(qū)室（CLIC／GEEC）和巨胞飲作用。

小窩是質(zhì)膜的小瓶狀內(nèi)陷，其特征是高水平的膽固醇和鞘糖脂，通過不依賴于網(wǎng)格蛋白的途徑介導(dǎo)內(nèi)吞作用，并且存在于大多數(shù)細胞類型中。小窩的主要支架蛋白是小窩蛋白，它是形成寡聚體的20–24 kDa完整膜蛋白。小窩蛋白共享共同的支架結(jié)構(gòu)域，這些支架結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與自身和其他包含小窩蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的相互作用。

雖然小窩具有類似CCPs的內(nèi)陷形態(tài)，但它們是不同的。簡單地說，CCP的密度是恒定的，而小窩的密度會因細胞類型的不同而變化很大。CCPs隨著萌發(fā)的內(nèi)體成熟而增大，相比之下，小窩囊泡保持不變的大小。一旦進入細胞內(nèi)，小窩就形成了高階結(jié)構(gòu)，而不是由CCPs形成的簡單的球形內(nèi)體。

小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的另一個獨特方面是，只有約1％的小窩是從質(zhì)膜上萌發(fā)的。在一小部分內(nèi)化的小窩中，它似乎遵循一條與Rab5（早期內(nèi)胚體的標志物）共定位的循環(huán)途徑。這可能對以利用小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體為靶點的ADC帶來挑戰(zhàn)。

CLIC／GEEC內(nèi)吞作用

CLIC／GEEC是一種內(nèi)吞室，主要發(fā)生在配體激活的細胞中，這可能由生長因子、抗體的受體交聯(lián)或細菌毒素和病毒引起。此外，細胞膜必須處于高流動性狀態(tài)，因為CLIC／GEEC在低于生理溫度或膜處于更高張力的情況下不起作用。

CLIC在遷移細胞的前緣增加。識別CLIC／GEEC途徑的其他相關(guān)參數(shù)包括動力非依賴性質(zhì)膜斷裂、對膽固醇消耗的敏感性、Rab5／與早期內(nèi)體融合的獲得、胎盤堿性磷酸酶（PLAP）和與FAK相關(guān)的GTPase調(diào)節(jié)因子（GRAF1）。

巨胞飲作用

巨胞飲作用是一種更大規(guī)模的內(nèi)吞作用形式，通常涉及質(zhì)膜高度皺折的區(qū)域／突起，這些區(qū)域／突起隨后相互融合或與質(zhì)膜融合。膜皺褶是巨胞飲作用的形態(tài)學(xué)特征。

巨胞飲作用依賴于肌動蛋白聚合、Rac1蛋白和p21活化激酶1（PAK1）。PAK1是一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，因為它與Rac1相互作用，Rac1激活磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）、Ras、Src和Hsp90，以促進巨胞飲作用。巨胞飲作用也是膽固醇依賴性的，這是招募Rac1所必需的。這些成分最終導(dǎo)致比CME和小窩蛋白更大吸收面積的內(nèi)吞作用。

ADC靶向抗原的內(nèi)吞特性

CD33

CD33是一種67kda跨膜糖蛋白受體，通常在正常髓系細胞上表達，由于其在AML細胞上優(yōu)先過表達，是GO的靶點。CD33的胞內(nèi)免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）調(diào)節(jié)CD33的內(nèi)吞作用，可通過CME激活內(nèi)吞作用。關(guān)于內(nèi)吞效率，AML細胞中CD33的表達水平與其內(nèi)吞率之間沒有相關(guān)性。CD33是一種緩慢內(nèi)化的抗原，此外，CD33交聯(lián)并不能改善內(nèi)吞作用。對GO無響應(yīng)的AML患者可能與CD33受體內(nèi)吞的功能低下有關(guān)。

CD30

CD30是一種120kda跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。其細胞外部分由六個擴展構(gòu)象的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）組成。CD30在活化的T細胞和B細胞以及各種淋巴腫瘤（包括霍奇金淋巴瘤和ALCL）上表達。

CD30不具有內(nèi)吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脫落，CD30的脫落由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）介導(dǎo)。脫落是CD30生物學(xué)的一個特征，高濃度的循環(huán)可溶性CD30可以作為監(jiān)測腫瘤進展的血清標志物。對于ADC的療效，升高的CD30循環(huán)水平似乎會隔離注射的ADC，從而減少能夠定位于CD30陽性腫瘤部位的ADC的數(shù)量。因此，缺乏內(nèi)吞作用的結(jié)果表明CD30不是理想的ADC靶點。

CD22

CD22是一種140 kDa的跨膜糖蛋白，與CD33一樣，它也是Siglec家族的成員，并與該家族共享多種結(jié)構(gòu)特征。關(guān)鍵的區(qū)別在于CD22比CD33大得多，因為它有多個Ig結(jié)構(gòu)域和ITIM／ITIM樣基序。CD22的表達僅限于B細胞，CD22在各種B細胞惡性腫瘤（包括ALL）的大多數(shù)母細胞中表達水平升高。

CD22通過CME進行內(nèi)吞作用。類天然配體通過CD22的結(jié)構(gòu)性快速內(nèi)吞在細胞內(nèi)積聚。這些配體在溶酶體中被分類降解，而CD22則循環(huán)回到細胞表面。此外，CD22配體誘導(dǎo)的內(nèi)吞激活細胞內(nèi)池，補充或增加細胞表面CD22的表達水平。因此，CD22對ADC具有良好的內(nèi)吞特性。

CD79b

CD79b僅在未成熟和成熟的B細胞中表達，在惡性腫瘤≥80％的B細胞中過表達。CD79a和CD79b是兩種非共價結(jié)合的跨膜蛋白，介導(dǎo)信號傳導(dǎo)和內(nèi)吞作用。對于后者，CD79a－CD79b異二聚體是控制BCR內(nèi)吞的支架。BCR內(nèi)吞作用主要由CME完成，并由AP－2介導(dǎo)。有趣的是，CD79a直接與AP－2的μ亞單位相互作用，進而激活CD79b并導(dǎo)致整個BCR復(fù)合物的內(nèi)吞。

此外，對于ADC來說，CD79a可以作為單體內(nèi)化，但CD79b卻不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸（Y195）發(fā)生突變，AP－2與CD79a的結(jié)合就會被阻斷，內(nèi)吞也被阻斷。在18％的活化B細胞樣DLBCL標本中，Y195發(fā)生突變�？傊�，有證據(jù)表明CD79b其內(nèi)吞活性依賴于整個BCR復(fù)合體的內(nèi)化，而不是作為單體的內(nèi)化。

TROP－2

Trop2是一種46kDa的單體糖蛋白，具有選擇性過度表達、結(jié)構(gòu)性內(nèi)吞作用和導(dǎo)向溶酶體等特性，使其成為ADC的一個非常有吸引力的靶點。Trop2的內(nèi)化機制與CME有關(guān)。

觀察到的Trop2強大的內(nèi)吞作用，一種潛在的解釋可能是由于顯著的Trop2聚集。研究Trop2的構(gòu)象動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Trop2通過位于跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸“VVVVV”組成的相互作用片段形成天然的同型二聚體。Trop2的二聚作用可以通過其他細胞表面蛋白質(zhì)進一步將Trop2單體招募到更接近的位置。因此，Trop2簇很可能由多個二聚體通過脂筏和其他膜結(jié)合蛋白連接而成。

Trop2與多種配體結(jié)合，如claudin－1、claudin－7、cyclin D1和IGF1，然而，這些配體都沒有證明在與Trop2結(jié)合或相互作用時被內(nèi)化。因此，與正常細胞相比，Trop2在腫瘤細胞中發(fā)生的內(nèi)吞作用更為強烈，這些都表明Trop2是ADC的一個很好的靶點。

BCMA

BCMA或CD269，也稱為TNFR超家族成員17，轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)B細胞存活和增殖的信號。BCMA的分子量僅為20．2 kDa，其配體結(jié)合的胞外區(qū)域具有“臂椅”構(gòu)象，由六個CRD組成。除了多發(fā)性骨髓瘤外，BCMA還表達于許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

然而，關(guān)于BCMA所利用的精確內(nèi)吞途徑的知之甚少。與內(nèi)吞作用有關(guān)，唾液酸化是一種調(diào)節(jié)功能，它可能誘導(dǎo)BCMA利用CME發(fā)生內(nèi)吞作用。

HER2

HER2是一種185kda跨膜糖蛋白，屬于EGFR家族。HER2／neu基因的擴增是已知的人類惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移的驅(qū)動因素。由于HER2在癌癥中的作用，幾十年來一直被作為治療靶點。HER2也一直是ADCs的靶點，T－DM1和T－DXT都被批準用于HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。

HER2的內(nèi)吞存在多種機制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的顯示HER2直接與AP－2結(jié)合，此外，dynasore能完全阻斷SKBR3細胞的HER2內(nèi)吞作用；其次小窩蛋白結(jié)合基序φxφxxxxφ（φ代表芳香族氨基酸Trp、Phe或Tyr）通常存在于小窩蛋白相關(guān)蛋白上，有趣的是，序列WSYGVTIW已在HER2的細胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域中被鑒定出；另外，有研究證明HER2可以利用CLIC／GEEC的內(nèi)吞途徑。

這些不同的發(fā)現(xiàn)揭示了HER2內(nèi)吞的重要特征。首先，HER2的內(nèi)吞作用是混雜的，其次，小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑似乎更常被利用。

Nectin－4

Nectin－4是一種66 kDa 的I型跨膜蛋白，其主要作用是促進細胞間的接觸。Nectin－4作為ADC靶點很有吸引力，因為研究表明，它在幾種腫瘤類型中過表達，但在正常成人組織中幾乎不存在。

目前，沒有發(fā)現(xiàn)天然配體或mAb／ADC與nectin－4的復(fù)合物內(nèi)吞的信息，但是可以借鑒nectin－4結(jié)合病原體內(nèi)吞的研究。Nectin－4也是麻疹病毒的受體，研究表明，麻疹病毒通過巨胞飲作用進入MCF7、HTB－20乳腺癌和DLD－1結(jié)直腸癌細胞。病毒進入需要PAK1，相反，dynamin抑制劑Dynasore對病毒進入沒有影響。此外，表達顯性負性小窩蛋白的細胞并不能消除病毒的內(nèi)吞作用。

基于這些間接研究，nectin－4表現(xiàn)出病毒受體所需的強大的內(nèi)吞活性。

小結(jié)

分析靶受體和ADC的內(nèi)吞作用內(nèi)吞可以極大地促進臨床前研究、臨床轉(zhuǎn)化和患者治療效果。很明顯，內(nèi)吞作用的效率和ADC靶受體的優(yōu)先過表達狀態(tài)以及其它相關(guān)參數(shù)（如PK）一樣重要。盡管目前已有11種已批準的ADC，但是由于ADC的技術(shù)進步，該領(lǐng)域正在經(jīng)歷一次爆發(fā)。

藥物劑量－暴露－效應(yīng)關(guān)系的確定是ADC成功的關(guān)鍵部分，因此，內(nèi)吞作用是這種關(guān)系的關(guān)鍵部分，對于優(yōu)化給藥方案以最大限度地提高治療指數(shù)非常重要。然而盡管目前ADC領(lǐng)域如火如荼，但是我們對靶受體的內(nèi)吞作用仍知之甚少。另外，許多內(nèi)吞作用的核心成分和關(guān)鍵的效應(yīng)器非常重要，然而這些蛋白可能在癌癥中普遍發(fā)生突變，這也會影響ADC內(nèi)吞作用和療效。相信隨著該領(lǐng)域的發(fā)展，經(jīng)過無數(shù)次積累的經(jīng)驗，ADC終會迎來真正的春天。

參考文獻：

1．Impact of EndocytosisMechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody－DrugConjugates （ADCs）—A Necessity for Future ADC Research and Development． Pharmaceuticals（Basel）． 2021 Jul； 14（7）： 674．