前言

免疫療法的巨大進展改變了目前癌癥治療的模式,然而,鑒于只有少數(shù)患者對免疫檢查點阻斷和其他免疫治療策略有響應(yīng),因此需要更多新技術(shù)來破譯腫瘤細胞與腫瘤免疫微環(huán)境(TME)成分之間復(fù)雜的相互作用。

腫瘤免疫組學(xué)是指利用免疫基因組學(xué)、免疫蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫生物信息學(xué)等反映腫瘤免疫狀態(tài)的多組學(xué)數(shù)據(jù)對TME進行的綜合研究,它依賴于下一代測序技術(shù)的快速發(fā)展。高通量基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可用于計算免疫細胞的豐度和預(yù)測腫瘤抗原,然而,由于批量測序代表了異質(zhì)細胞群的平均特征,因此無法區(qū)分不同的細胞亞型�；�于單細胞的技術(shù)能夠通過精確的免疫細胞亞群和空間結(jié)構(gòu)研究更好地解析TME。此外,基于放射組學(xué)和數(shù)字病理學(xué)的深度學(xué)習(xí)模型在很大程度上有助于腫瘤免疫的研究,這些人工智能技術(shù)在預(yù)測免疫治療反應(yīng)方面表現(xiàn)良好。這些新技術(shù)的進展和突破對癌癥治療具有深遠意義。

腫瘤免疫微環(huán)境

在過去幾年中對腫瘤免疫的研究進展,使我們對腫瘤的認識發(fā)生了根本的改變。腫瘤的定義也從單純的腫瘤細胞聚集演變?yōu)橐粋�復(fù)雜的器官樣結(jié)構(gòu),由腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和周圍的其他基質(zhì)細胞組成。腫瘤附近的各種細胞和成分,如免疫浸潤細胞、血管,細胞外基質(zhì)等構(gòu)成的結(jié)構(gòu),也稱為腫瘤免疫微環(huán)境,已成為腫瘤學(xué)最熱門的研究課題之一。TME已被證明在癌癥發(fā)生、腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著決定性的作用。

TME包含了極其多樣的免疫細胞亞群,包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、粒細胞和髓源性抑制細胞(MDSCs)等。通常,T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞有助于抑制腫瘤生長,而MDSC和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)傾向于抑制抗腫瘤免疫。然而,現(xiàn)有研究已經(jīng)證實,鑒于與腫瘤細胞的復(fù)雜相互作用,免疫細胞的特定作用可能會發(fā)生動態(tài)變化,甚至變得完全相反。

總之,各種各樣的免疫細胞類型,甚至特定免疫細胞類型的不同功能狀態(tài)都可能對抗腫瘤免疫產(chǎn)生截然相反的效果。因此,這就需要借助最先進的生物信息學(xué)技術(shù),從而在最大程度上系統(tǒng)地描述腫瘤的免疫學(xué)特征,并提供更多的信息來增強我們對腫瘤免疫的理解。

NGS時代的免疫基因組學(xué)

在過去二十年中,包括全基因組測序(WGS)、全外顯子組測序(WES)和RNA測序(RNA seq)在內(nèi)的NGS已成功開發(fā)并應(yīng)用于獲取人類全基因組信息。NGS產(chǎn)生高通量基因組和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù),為研究多步免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。

量化TME中的免疫細胞

TME由多種免疫細胞組成,對于腫瘤免疫細胞組分的定量,傳統(tǒng)的方法,如流式細胞術(shù)和免疫組織化學(xué)(IHC),由于其高成本和低組織可用性,不適用于大規(guī)模分析。隨著NGS的快速發(fā)展,我們能夠通過NGS數(shù)據(jù)估計幾十種免疫細胞類型的豐度,這些數(shù)據(jù)也被證實是可靠的。這些分析的來源主要是DNA和RNA測序,尤其是后者。關(guān)于RNA序列數(shù)據(jù),計算方法的原理主要分為基因集富集分析(GSEA)和逆卷積。

通常,基于GSEA的代表性算法包括ESTIMATE、xCell和MCP計數(shù)�；�于GSEA的方法的一個共同特點是需要為每個感興趣的免疫細胞亞群建立特定的基因集。細胞成分的逆卷積是基于基因表達特征的體組織中細胞亞型卷積的反向過程�；�于逆卷積的工具包括decornaseq、PERT、CIBERSORT、TIMER、EPIC、quanTIseq和deconf．

腫瘤抗原的鑒定

體細胞DNA突變,包括單核苷酸變異(SNV)和插入和缺失(INDEL),是異�？乖�的主要來源。目前,基因組分析工具包(GATK)是通過分析WES、WGS和RNA序列數(shù)據(jù)來識別SNV和INDEL的行業(yè)標準。其范圍也在擴大,以涵蓋拷貝數(shù)變異(CNVs)和結(jié)構(gòu)變異(SVs)。

此外,異常肽需要與HLA結(jié)合,以協(xié)助T細胞受體(TCR)識別,從而引發(fā)免疫反應(yīng)。預(yù)測HLA分型對于識別腫瘤抗原至關(guān)重要。HLA miner和Seq2HLA是用于從NGS數(shù)據(jù)進行HLA分型的兩種早期工具,PHLAT、HLAreporter、SNP2HLA、HLA-HD、optype和HLA-VBSeq在不同癌癥中的四位、六位和八位分辨率表現(xiàn)都相當出色。在這些工具中,Polysolver是目前使用低覆蓋率WES數(shù)據(jù)的公認標準工具之一。

除了識別異常肽和HLA分型外,抗原MHC結(jié)合親和力是腫瘤抗原預(yù)測的下一個重點。許多肽-MHC-I(pMHC-I)親和力預(yù)測工具是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)訓(xùn)練方法和位置特異性評分矩陣(PSSM),如目前廣泛使用的工具NetMHC和NetMHCpan。而由于MHCII結(jié)合肽長度的多樣性和結(jié)合區(qū)的“開放性”,預(yù)測pMHC II親和力更具挑戰(zhàn)性,可用的pMHC II親和力預(yù)測方法的數(shù)量遠遠少于pMHC-I。

單細胞時代的免疫組學(xué)

盡管利用NGS技術(shù)研究腫瘤免疫的研究極大地促進了腫瘤學(xué)的發(fā)展,但批量測序可能會導(dǎo)致信號稀釋到檢測限以下,并掩蓋單個細胞的反應(yīng)。這可能會掩蓋許多重要的生物學(xué)現(xiàn)象。直到最近,單細胞相關(guān)方法的技術(shù)突破徹底改變了我們對腫瘤免疫的理解,并將研究水平從區(qū)域水平過渡到單細胞水平。

多色流式細胞術(shù)

多參數(shù)分析在功能上和物理上區(qū)分不同免疫細胞亞群的能力已促使流式細胞儀發(fā)展為常規(guī)使用的8參數(shù)流式細胞儀。此外,隨著技術(shù)的進步,可以測量更多參數(shù)的儀器設(shè)計已經(jīng)實現(xiàn),例如30參數(shù)和50參數(shù)流式細胞儀。然而,由于更可測量的參數(shù)精度較低,或更高精度可測量的參數(shù)有限,特別是由于熒光染料發(fā)射光譜之間的重疊,這些缺點在一定程度上限制了多色流式細胞術(shù)的應(yīng)用和進一步發(fā)展。

質(zhì)譜流式細胞術(shù)

質(zhì)譜是該領(lǐng)域的一項最新創(chuàng)新,也稱為飛行時間(CyTOF)流式細胞儀,將流式細胞儀與質(zhì)譜儀相結(jié)合。與傳統(tǒng)流式細胞儀相比,質(zhì)譜儀用金屬同位素而不是熒光團標記抗體,然后使用飛行時間檢測器對信號進行量化,該檢測器可檢測至少40個參數(shù),并避免光譜重疊問題。CyTOF已被證實是一種精確的腫瘤組織高維分析方法,用于探索性免疫分析和生物標記物發(fā)現(xiàn)。

雖然從理論上講,質(zhì)譜流式細胞術(shù)允許我們檢測每個細胞最多100個參數(shù),但處理速度和通量受到離子飛行的限制。在霧化和電離后,細胞在預(yù)處理過程中被完全破壞,導(dǎo)致后續(xù)細胞分類應(yīng)用不可行。此外,關(guān)于測量某些低表達分子特征,CyTOF可能因其低靈敏度而不合適。

光譜流式細胞術(shù)

光譜流式細胞術(shù)是促進傳統(tǒng)流式細胞術(shù)功效的另一項最新技術(shù)進步。與質(zhì)譜儀不同,光譜流式細胞儀仍然用熒光染料標記抗體,但用色散光學(xué)和測量全發(fā)射光譜的新型探測器取代了傳統(tǒng)光學(xué)和探測器�；�于相同的原理,傳統(tǒng)的流式細胞術(shù)和光譜流式細胞術(shù)保持了相當好的兼容性,特別是在商業(yè)抗體的可用性方面,但可以更好地消除混淆因素,如光譜重疊,以提高效率。隨著補償技術(shù)的發(fā)展,光譜流式細胞術(shù)有可能取代多色流式細胞術(shù)。

單細胞RNA測序

基于流式細胞術(shù)的技術(shù)將特定標簽與相應(yīng)的細胞亞群結(jié)合并識別該標簽,表明必須在樣本采集之前確定目標,而最初的目標限定限制了從這些技術(shù)中獲得的信息,只能通過這些技術(shù)找到“已知的未知的”。

單細胞測序技術(shù)的出現(xiàn)將單細胞領(lǐng)域推向了新的高度。不再受流式細胞術(shù)等預(yù)定目標的限制,可以使用標準NGS協(xié)議對單個細胞進行測序,以獲得可用于識別“未知”的無偏多組學(xué)分析。

目前,scRNA-seq的應(yīng)用相對其他方法更為成熟,再腫瘤免疫治療領(lǐng)域為我們提供了很多非常有價值的發(fā)現(xiàn)和啟示。然而,微量物質(zhì)放大產(chǎn)生的技術(shù)噪音仍然是最重大的挑戰(zhàn)。如何分離單個細胞并保持其生物活性,如何解決放大帶來的巨大技術(shù)噪音并提高靈敏度,如何以最低的價格獲得最高數(shù)量的可測量基因,如何更有效地分析數(shù)據(jù),這些都大大提高了單細胞測序的門檻,限制了它的廣泛應(yīng)用。

免疫組學(xué)與人工智能

人工智能在腫瘤免疫研究中的技術(shù)進展主要涉及以下幾個方面:(1)減輕了人工識別病理切片上免疫浸潤的工作量;(2) 提供了一種替代技術(shù)來識別肉眼難以識別的免疫細胞亞群和空間結(jié)構(gòu);(3)提供一種非侵入性方法來預(yù)測特定患者的TME特征和對免疫治療的反應(yīng)。

基于深度學(xué)習(xí)方法的腫瘤抗原預(yù)測

破譯腫瘤抗原的第一步是預(yù)測異常肽。除了識別SNV的多種算法外,最近設(shè)計的CN學(xué)習(xí)工具也被設(shè)計用于檢測CNV,表現(xiàn)出良好的性能。關(guān)于HLA分型,Bulik等人生成了一個大型綜合數(shù)據(jù)集,包括各種類型癌癥組織的HLA類型和HLA肽,并公布了可用于訓(xùn)練完整質(zhì)譜深度學(xué)習(xí)模型EDGE的數(shù)據(jù),該模型已在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中得到驗證。此外,最近開發(fā)了兩種很有前途的計算深度學(xué)習(xí)方法MARIA和MixMHC2pred,大大提高了MHC-II預(yù)測精度。

放射組學(xué)在腫瘤免疫中的應(yīng)用

隨著人工智能在醫(yī)學(xué)影像學(xué)中的發(fā)展,影像已經(jīng)不僅僅是一張圖片,而是一個大規(guī)模的數(shù)字數(shù)據(jù),使用AI技術(shù)分析成像數(shù)據(jù)的過程就是放射組學(xué)。應(yīng)用于腫瘤免疫的放射組學(xué)技術(shù)主要用于識別反映免疫浸潤的生物標記物,并預(yù)測ICB治療患者的治療反應(yīng)。            

腫瘤免疫中的計算病理學(xué)

病理學(xué)中的AI,或所謂的數(shù)字病理學(xué),通過計算分析,為探索免疫細胞和腫瘤細胞之間的相互作用以及癌癥生物學(xué)關(guān)鍵行為之間的聯(lián)系提供了新的見解。

與放射學(xué)相似,數(shù)字病理學(xué)結(jié)合深度學(xué)習(xí)從圖像中挖掘出看不見的信息,使我們能夠在細胞或分子水平上理解TME。數(shù)字病理學(xué)可能是研究TME結(jié)構(gòu)以及癌癥生物學(xué)和治療之間關(guān)系的一種有希望的方法。

免疫組學(xué)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

識別ICB的生物標志物用于患者分層

作為ICB的一個靶點,IHC檢測到的PD-L1表達水平是第一個發(fā)現(xiàn)的預(yù)測性生物標記物,但一些臨床試驗表明ICB對一些PD-L1高表達患者僅具有輕微療效,而ICB也會對PD-L1低表達患者有響應(yīng)。因此,迫切需要其他生物標記物來填補這一空白。

2014年,研究人員首次通過WES將腫瘤突變負荷(TMB)與接受CTLA-4抑制劑治療的患者的臨床生存率聯(lián)系起來。隨后,其他回顧性研究也證明,高TMB與持久的臨床益處相關(guān)。關(guān)于用于評估TMB的方法,由于WES的高成本和復(fù)雜性,FDA批準了兩個替代NGS平臺,即FoundationOne CDx(F1CDx)和MSKCC可操作癌癥靶點綜合突變譜(MSK-IMPACT),并通過多個癌癥的前瞻性研究進行了驗證。

另一方面,免疫細胞浸潤,特別是TIL,在免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。為了發(fā)現(xiàn)更理想的治療和預(yù)后生物標志物,單細胞測序被用于鑒定更多的免疫細胞亞群。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TCF7+記憶樣T細胞與抗PD1治療后黑色素瘤患者的臨床改善相關(guān),而干細胞樣TCF1+PD1+T細胞經(jīng)證實,在ICB治療中有助于腫瘤控制。通過單細胞測序技術(shù),更多與治療和預(yù)后相關(guān)的T細胞亞群和功能狀態(tài)被確定。

ACT治療中新抗原的預(yù)測

過繼細胞療法(ACT)是通過轉(zhuǎn)基因或擴增的自體或異體T細胞重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi),以增強抗腫瘤免疫。免疫組學(xué)主要用于在ACT治療中識別理想的腫瘤抗原。

目前,新抗原特異性TCR-T細胞尚未進入臨床應(yīng)用,然而,令人欣慰的是,一些病例報告顯示了免疫組學(xué)預(yù)測的結(jié)直腸癌、乳腺癌和膽管癌患者T細胞識別腫瘤新抗原的有效性。Tran等人對轉(zhuǎn)移性膽管癌患者的樣本進行WGS,確定了26種體細胞突變。將由突變基因組成的串聯(lián)微基因轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)染到自體APC中,然后將新抗原呈遞APC與患者來源的TIL共培養(yǎng),最終鑒定抗原特異性CD4+Vb22+T細胞克隆,誘導(dǎo)上皮癌消退。

傳統(tǒng)的基于自體APC和T細胞共培養(yǎng)的新抗原選擇由于其低通量、高成本和耗時的特性而受到限制。為了消除這些障礙,開發(fā)了更多高通量免疫原性新抗原檢測技術(shù)。Li等人建立了一個基于trogocytosis的平臺,在該平臺中,當TCR和pMHC結(jié)合時,表面標記蛋白就從APC轉(zhuǎn)移到T細胞。因此,可以通過分析標記蛋白陽性細胞來識別理想的新抗原。未來,這些新興的免疫基因組學(xué)技術(shù)將實現(xiàn)高通量新抗原選擇。

為個體化腫瘤疫苗選擇新抗原

免疫組學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于臨床研究中的疫苗開發(fā)。一般來說,用于生成個性化疫苗的新抗原是通過分析腫瘤和正常組織的WES和RNA序列,并通過算法(如NetMHCpan)預(yù)測有效表位來識別的。

與ACT相似,腫瘤疫苗開發(fā)的關(guān)鍵參數(shù)是理想的新抗原鑒定。為了提高新抗原預(yù)測的準確性和免疫原性新表位選擇管道,免疫組學(xué)技術(shù)在這些方面做著不懈的努力。在最近的一項研究中,Wells等人匯編了所有新抗原預(yù)測和選擇方法,并提供了一個全新的候選測定管道,其中包括MHC呈遞和T細胞識別的14個免疫原性特征。本研究為提高腫瘤疫苗的療效和過繼性細胞治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。

小結(jié)

近年來,伴隨著免疫組學(xué)領(lǐng)域新興技術(shù)的巨大飛躍,我們現(xiàn)在能夠以前所未有的深度解析腫瘤免疫。

在批量測序時代,使我們能夠更好地探索腫瘤免疫細胞的個體浸潤模式,以及異常肽的預(yù)測、HLA分型和腫瘤抗原MHC結(jié)合親和力的預(yù)測,使用免疫組學(xué)技術(shù)預(yù)測腫瘤抗原已在臨床前和臨床研究中證明了其可靠的功效。

此外,隨著單細胞免疫相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,從多色流式細胞術(shù)到CyTOF,單細胞腫瘤免疫圖譜幫助我們進行免疫細胞亞群分類,以破譯TME成分。人工智能的出現(xiàn)也為免疫組學(xué)的發(fā)展提供了新的方向。

隨著免疫組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展,可持續(xù)發(fā)展需要考慮幾個問題。首先,盡管已經(jīng)實施了許多質(zhì)量控制和改進算法原理的方法,但這些技術(shù)的有效性仍有待提高。特別是在腫瘤抗原預(yù)測、單細胞測序和空間上分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面,技術(shù)噪音和混雜因素阻礙了后續(xù)分析。其次,期待更具成本效益、更易獲取和更自動化的技術(shù)出現(xiàn),從而徹底改變學(xué)科的發(fā)展。第三,我們還期望研究人員充分利用現(xiàn)有技術(shù)探索腫瘤免疫,促進臨床轉(zhuǎn)型。

盡管還有很多工作要做,但免疫組學(xué)很可能在未來的腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位,其臨床價值無疑將極大地促進該學(xué)科在免疫組學(xué)、單細胞和人工智能領(lǐng)域的發(fā)展。

參考文獻:

1．Technological advances in cancer immunity:from immunogenomics to single-cell analysis and artificial intelligence． SignalTransduct Target Ther． 2021; 6: 312．