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前言

針對免疫檢查點(diǎn)（如PD－1、CTLA－4）癌癥免疫治療的臨床成功開創(chuàng)了癌癥治療的新時代。然而，免疫治療固有的和后天的耐藥性限制了患者的受益和更廣泛的應(yīng)用。對免疫治療反應(yīng)和抵抗機(jī)制的研究已經(jīng)證實(shí)了關(guān)鍵的腫瘤內(nèi)在和外在因素，研究多種細(xì)胞類型的復(fù)雜相互作用對于理解癌癥治療的反應(yīng)和耐藥性機(jī)制十分關(guān)鍵。

但是，缺乏能夠真實(shí)再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境（TME）關(guān)鍵特征的模型系統(tǒng)仍然是癌癥研究者面臨的一個挑戰(zhàn)。近年來，患者源性腫瘤模型的出現(xiàn)，促進(jìn)了腫瘤免疫動力學(xué)的研究。微流控技術(shù)使微物理系統(tǒng)（MPS）的發(fā)展成為可能，用于評估腫瘤微環(huán)境，在研究腫瘤免疫動力學(xué)方面顯示出良好的應(yīng)用前景。進(jìn)一步開發(fā)基于微流控的“芯片上腫瘤”的MPS來研究腫瘤－免疫相互作用可能會克服目前腫瘤免疫學(xué)面臨的幾個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

腫瘤微環(huán)境

腫瘤在TME中形成和發(fā)展，TME不僅包含腫瘤細(xì)胞，還包含基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展既受腫瘤內(nèi)遺傳或獲得性突變的影響，也受腫瘤周圍TME中多種成分的相互作用的影響，包括細(xì)胞、信號因子和支持性結(jié)構(gòu)分子。值得注意的是，腫瘤異質(zhì)性存在于不同患者之間、同一患者的不同病變內(nèi)以及單個腫瘤的不同區(qū)域。在TME中存在的免疫和基質(zhì)成分中也觀察到這種異質(zhì)性。更重要的是，這種異質(zhì)性隨著時間的推移是動態(tài)的。

腫瘤微環(huán)境是細(xì)胞和非細(xì)胞成分的高度異質(zhì)性混合物，包括成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、間充質(zhì)基質(zhì)／干細(xì)胞（MSCs）、血管系統(tǒng)、平滑肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)和信號因子。在TME的背景下，隨著單細(xì)胞RNA測序、質(zhì)譜儀和多參數(shù)成像等技術(shù)的發(fā)展，分析了TME的復(fù)雜性和多樣性及其對治療反應(yīng)的影響。

根據(jù)免疫成分和狀態(tài)，TME被分為三種類型，包括浸潤－排斥、浸潤－炎癥和浸潤－三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）。浸潤－排斥TME的特征是細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）排斥在腫瘤核心外，CTL定位于腫瘤周圍。浸潤－炎癥TME的特征是腫瘤細(xì)胞和髓系細(xì)胞上大量表達(dá)PD－L1，CTL高度激活，表達(dá)顆粒酶B、IFN－γ和PD－1。浸潤－TLSTME含有TLS，其免疫細(xì)胞成分與淋巴結(jié)類似，包括B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和Treg細(xì)胞。

最近，通過分析20種不同癌癥中10000多名癌癥患者的轉(zhuǎn)錄組信息，Bagaev等人確定了四種TME亞型：免疫富集型和纖維化型（IE／F）、免疫富集型和非纖維化型（IE）、纖維化型（F）和免疫耗竭型（D）。IE／F亞型為免疫性炎癥，以CAF激活和血管生成相關(guān)功能基因表達(dá)上調(diào)為特征。IE亞型高度浸潤，顯示T細(xì)胞活性增加。F和D亞型均缺乏或僅有少量淋巴細(xì)胞浸潤。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些TME亞型與免疫治療的反應(yīng)相關(guān)，其中具有良好免疫微環(huán)境的患者往往從免疫治療中獲益最多。

腫瘤微環(huán)境建模

TME中復(fù)雜的細(xì)胞相互作用影響對癌癥治療的反應(yīng)和耐藥性。開發(fā)更復(fù)雜和臨床相關(guān)的TME模型不僅可以提供一種可靠的方法來評估新治療方案的療效，還可以促進(jìn)我們對腫瘤細(xì)胞和TME之間相互作用的理解，從而進(jìn)一步促進(jìn)有效抗癌策略的識別。隨著生物工程和動物模型的發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)出多種復(fù)雜的體內(nèi)、二維和三維癌癥模型。

體內(nèi)模型

小鼠模型可以提供一個完整的先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，允許在TME的影響下開發(fā)來自同基因移植或基因工程的腫瘤。同基因植入小鼠腫瘤模型仍然是研究TME和評估免疫療法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。通過將自發(fā)的、致癌物誘導(dǎo)的或轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞系接種到近交系，如C57BL／6、BALB／c和FVB小鼠，同基因小鼠發(fā)展出與宿主免疫系統(tǒng)相互作用并成為免疫浸潤的腫瘤。

鑒于觀察到的人類和小鼠腫瘤之間的差異，研究人員開發(fā)了人源化小鼠模型，用匹配的人類腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞在免疫缺陷宿主小鼠中重建人類腫瘤－免疫系統(tǒng)。這些人源化小鼠為研究腫瘤－免疫細(xì)胞相互作用和評估免疫治療反應(yīng)提供了一個有好的臨床前模型。然而，它們需要自體免疫重建，并且免疫重建的持續(xù)時間相對較短，限制了它們的廣泛應(yīng)用。盡管這些模型并不完美，但它們已經(jīng)在評估植入人體腫瘤組織的治療效果方面取得了巨大進(jìn)展。

二維培養(yǎng)模型

基于永生化細(xì)胞系的傳統(tǒng)2D培養(yǎng)系統(tǒng)由于其低成本和高通量的能力，已被癌癥生物學(xué)家廣泛用于研究腫瘤生物學(xué)和測試抗癌療法，尤其是研究作用機(jī)制。

然而，當(dāng)從腫瘤塊中分離細(xì)胞，然后在2D條件下（塑料瓶或培養(yǎng)皿）培養(yǎng)時，細(xì)胞失去了細(xì)胞－細(xì)胞和細(xì)胞－細(xì)胞外環(huán)境的相互作用，這對其生理功能至關(guān)重要，如細(xì)胞分化、基因表達(dá)和對刺激的反應(yīng)。此外，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞極性也會發(fā)生變化。

2D培養(yǎng)系統(tǒng)的另一個缺點(diǎn)是缺乏腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性和異質(zhì)性，使其成為研究復(fù)雜癌癥生物學(xué)和試驗(yàn)臨床前藥物的較不可靠的模型系統(tǒng)。

三維培養(yǎng)模型

3D腫瘤模型越來越多地用于更真實(shí)地再現(xiàn)體內(nèi)觀察到的生物學(xué)。3D腫瘤模型開發(fā)的核心是3D培養(yǎng)設(shè)備和生物材料，作為腫瘤細(xì)胞、球體或類有機(jī)物生存和生長的支架。大多數(shù)3D腫瘤模型使用從動物或植物中純化的天然生物材料，這些材料可以被腫瘤和／或基質(zhì)細(xì)胞酶消化。3D腫瘤模型中常用的天然生物材料包括膠原蛋白、明膠、基質(zhì)凝膠、水凝膠、殼聚糖、海藻酸鈉、蠶絲、聚ε－己內(nèi)酯（PCL）和透明質(zhì)酸。這些生物材料可單獨(dú)使用或組合使用，并應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞或球體。

通過集成3D培養(yǎng)系統(tǒng)和生物材料，已經(jīng)開發(fā)出多種3D培養(yǎng)模型，包括球體、類器官和3D生物打印，并應(yīng)用于各種類型的癌癥。多細(xì)胞腫瘤球體（MTS）由多個自組裝成3D球形結(jié)構(gòu)的癌細(xì)胞組成。因此，它們可以在3D環(huán)境中捕捉細(xì)胞相互作用，并可以維持特定的細(xì)胞形態(tài)，以及模擬類似于體內(nèi)條件的代謝和增殖梯度。

類器官是通常由干細(xì)胞或祖細(xì)胞產(chǎn)生的3D細(xì)胞簇，嵌入細(xì)胞外基質(zhì)中，自發(fā)形成器官樣或組織樣結(jié)構(gòu)。它們可以擴(kuò)展用于長期培養(yǎng)，保存原始組織的組織學(xué)和遺傳特征，并且可以進(jìn)行冷凍保存以促進(jìn)長期的反復(fù)實(shí)驗(yàn)。由于類器官也易于遺傳操作，基于類器官的3D腫瘤模型已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括癌癥研究。

3D生物打印是一種創(chuàng)新的計(jì)算機(jī)輔助工程技術(shù)，可在生理3D模型中生成包含多種細(xì)胞類型的3D組織結(jié)構(gòu)。它可以有效地重現(xiàn)TME的關(guān)鍵成分，并且適合于高通量篩選或測試各種癌癥模型中的藥物療效。

3D培養(yǎng)為評估藥物療效提供了一個更具生理相關(guān)性的環(huán)境，也為篩選潛在藥物靶點(diǎn)提供了一個理想的系統(tǒng)。然而，必須強(qiáng)調(diào)的是，選擇的平臺通常由感興趣的特定過程決定，并且特定于模型的特性可能會影響結(jié)果，因此需要進(jìn)行跨模型驗(yàn)證。

微流控技術(shù)

微流控技術(shù)是一種可以操縱在數(shù)百毫米長度的通道中的微小流體（10?9至10?18 L）的技術(shù)。由于TME內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的細(xì)胞體積與細(xì)胞外液體積大于1（即細(xì)胞外液體積更小），微流控裝置的尺寸使其非常適合用于研究和模擬TME的生物學(xué)應(yīng)用。微流控技術(shù)的另一個特點(diǎn)是其低雷諾系數(shù)（Re），這是指流體上慣性力與粘性力的比率。當(dāng)Re值較低時，微流控系統(tǒng)中的流體流動為層流，這意味著質(zhì)量主要通過擴(kuò)散傳遞。這使得在微流控系統(tǒng)中在時間和空間上產(chǎn)生可溶性因子的濃度梯度成為可能。

微流控裝置也被稱為“器官芯片”或“組織芯片”，使用塑料材料或其他光學(xué)透明材料形成灌流空心微通道，可以模擬脈管系統(tǒng)。雖然聚二甲基硅氧烷（PDMS）通常用于制造微流控裝置，但已經(jīng)驗(yàn)證了幾種剛性熱塑性聚合物（例如聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物），以克服PDMS的關(guān)鍵限制，例如疏水分子的吸附和蒸發(fā)。此外，隨著微流控技術(shù)的發(fā)展和人們對該系統(tǒng)的優(yōu)化，許多復(fù)雜的微流控設(shè)備已被開發(fā)用于特定功能。

微流控技術(shù)在腫瘤免疫的應(yīng)用

通過將微流控技術(shù)與3D培養(yǎng)系統(tǒng)相結(jié)合，研究人員可以控制基質(zhì)結(jié)構(gòu)、基質(zhì)剛度、細(xì)胞組成和比率、流速和其他特征。這些設(shè)備還可以與高分辨率實(shí)時成像結(jié)合，以探索特定器官或疾病背景下的各種臨床前分析。微流控技術(shù)已廣泛應(yīng)用于癌癥生物學(xué)和癌癥免疫治療的許多方面的研究，包括腫瘤生長、癌細(xì)胞外滲、血管生成、免疫治療反應(yīng)和藥物篩選。

腫瘤生長

癌細(xì)胞的標(biāo)志性特征之一是持續(xù)的增殖信號，導(dǎo)致細(xì)胞生長失控。3D微流控設(shè)備已被用于探索TME中不同細(xì)胞亞型和影響癌細(xì)胞增殖的因素之間的相互作用。

為了研究成纖維細(xì)胞和ECM蛋白對癌細(xì)胞生長和遷移的影響，Lugo Cintroón等人在微流控裝置中將乳腺癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞通過增加培養(yǎng)基中金屬蛋白酶（MMPs）的水平促進(jìn)癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)更多的遷移。

腫瘤遷移和外滲

癌細(xì)胞外滲是循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞通過血管在次要部位形成沉積的過程。微流控建模能夠評估腫瘤細(xì)胞／內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和腫瘤細(xì)胞的外滲。與研究細(xì)胞遷移的傳統(tǒng)方法（如transwell分析和劃痕分析）相比，這種基于微流控的平臺在介質(zhì)通道中使用內(nèi)皮細(xì)胞單層來模擬微血管，提供更具生理相關(guān)性的微環(huán)境，以研究癌癥－血管串?dāng)_，并確定參與腫瘤細(xì)胞遷移潛能調(diào)節(jié)的因素。利用這項(xiàng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了幾種細(xì)胞因子，如IL－6、IL－8和MMP－3分泌水平的增加與外滲呈正相關(guān)。

血管生成

血管生成對腫瘤生長特別重要。已經(jīng)開發(fā)了多種基于微流控的血管生成模型，以模擬體外新血管形成的起始。其中一項(xiàng)研究證明了在微流控裝置中重建血管生成芽，以及如何應(yīng)用該模型來確定潛在血管生成抑制劑對體外芽形成的影響。

腫瘤轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，因此，研究癌癥進(jìn)展中這一關(guān)鍵步驟的潛在機(jī)制非常重要。Cho等人開發(fā)了一種具有淋巴管－組織－血管結(jié)構(gòu)的三通道微流控裝置，以研究炎癥細(xì)胞因子在淋巴轉(zhuǎn)移中的作用，并發(fā)現(xiàn)IL－6通過介導(dǎo)TME中的細(xì)胞間相互作用誘導(dǎo)上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

TME建模

忠實(shí)地再現(xiàn)TME關(guān)鍵成分的腫瘤模型可促進(jìn)預(yù)測癌癥治療敏感性的應(yīng)用，為個性化或精準(zhǔn)治療策略鋪平道路。微流控設(shè)備是此類應(yīng)用的理想選擇，因?yàn)門ME中的多個組件可以單獨(dú)控制。

例如，Jeong等人展示了一種微流控芯片，該芯片允許腫瘤球體與CAF共同培養(yǎng)，以監(jiān)測其相互作用，為研究腫瘤細(xì)胞與CAF的串?dāng)_提供了一個平臺。另一種類似的方法已被用于模擬腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，以及腫瘤與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用。

此外，還開發(fā)了微流控裝置來模擬TME的其他功能。例如，Michna等人描述了一種包含互連微通道的新平臺，以模擬高度血管化系統(tǒng)。其他研究還側(cè)重于開發(fā)微流控芯片以控制氧濃度。

免疫細(xì)胞遷移／招募

模擬免疫細(xì)胞遷移對于理解腫瘤－免疫動態(tài)相互作用和免疫治療反應(yīng)至關(guān)重要。通過集成顯微技術(shù)，可以實(shí)時監(jiān)測微流控芯片模擬的細(xì)胞遷移。

許多研究利用微流控技術(shù)探索免疫細(xì)胞遷移在癌癥發(fā)展中的作用。一項(xiàng)研究證明了含有基于管腔的血管成分的微流控系統(tǒng)用于研究中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，揭示了IL－8在促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化和啟動中的關(guān)鍵作用。招募的中性粒細(xì)胞增加了局部活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而促進(jìn)細(xì)胞粘附和趨化因子受體的上調(diào)。

T淋巴細(xì)胞活化

盡管已采用多種分析方法檢測T細(xì)胞活化和效應(yīng)T細(xì)胞功能，但在刺激條件下實(shí)時監(jiān)測3D環(huán)境中的T細(xì)胞激活更有價值。Park等人使用微流控系統(tǒng)監(jiān)測T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，并將其應(yīng)用于識別可能調(diào)節(jié)這種相互作用的潛在藥物。

治療評估

3D微流控技術(shù)已用于測試對ICI單獨(dú)或與其他方案聯(lián)合的免疫治療反應(yīng)。為了利用該系統(tǒng)評估免疫治療反應(yīng)，使用了多種敏感和耐藥的同源模型來驗(yàn)證該系統(tǒng)的穩(wěn)健功能。

應(yīng)用這種策略，Deng等人發(fā)現(xiàn)CDK4／6抑制劑和PD－1阻斷劑的組合通過促進(jìn)T細(xì)胞浸潤和活化來提高治療效果。同時，Sade Feldman等人進(jìn)行了scRNA序列分析，并定義了兩種不同的CD8＋T細(xì)胞狀態(tài)，即CD8＋CD39?TIM3?和CD8＋CD39＋TIM3＋，可作為檢查點(diǎn)免疫治療成功或失敗的預(yù)測指標(biāo)。

疾病和治療反應(yīng)監(jiān)測

疾病和治療反應(yīng)監(jiān)測是作出臨床決定和預(yù)測所必需的。許多微流控設(shè)備已經(jīng)適應(yīng)了這些領(lǐng)域的功能。目前，CellSearch設(shè)計(jì)的微流控裝置已獲得FDA批準(zhǔn)，用于預(yù)測預(yù)后，評估患者的無進(jìn)展生存率和總生存率。該設(shè)備利用靶向EpCAM的抗體包被磁粉檢測和量化轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌患者全血中上皮來源的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）。

除CTC外，一些免疫親和微流控裝置已用于捕獲液體活檢中的外泌體。其中一個來自ExoSearch，利用微流控裝置中的濃縮血漿外泌體，免疫磁珠可用于捕獲和測量外泌體腫瘤標(biāo)記物（如CA－125、EpCAM和CD24）。由于一些外泌體已被證明會抑制抗腫瘤免疫，因此有希望監(jiān)測外泌體上的免疫治療反應(yīng)相關(guān)標(biāo)記物（如PD－L1）以預(yù)測ICI療效。

藥物篩選

目前，人們對開發(fā)3D腫瘤模型以改進(jìn)癌癥藥物開發(fā)的興趣越來越大�；�于微流控技術(shù)的藥物檢測能夠減少所需試劑的體積，并且可以適應(yīng)并行化和潛在的自動化。

盡管大多數(shù)基于微流控設(shè)備的藥物篩選應(yīng)用都處于概念驗(yàn)證階段，但有幾個小組已經(jīng)嘗試開發(fā)微流控系統(tǒng)來進(jìn)行藥物篩選。例如，Bhise等人通過3D打印技術(shù)開發(fā)了一個芯片肝臟平臺，使用肝臟球體作為材料源，將肝臟組織直接打印到微流控設(shè)備中。作者進(jìn)一步證明，生物打印的肝球體可以在設(shè)備中長期培養(yǎng)，并用作藥物毒性測試平臺。

小結(jié)

癌癥治療在過去十年中取得了長足的進(jìn)步，尤其是靶向治療和免疫治療的應(yīng)用，但固有和獲得性耐藥性仍然是一個持續(xù)的挑戰(zhàn)。關(guān)于腫瘤和TME的異質(zhì)性以及腫瘤－免疫相互作用的動態(tài)性質(zhì)仍然需要進(jìn)一步研究。 此外，隨著多種聯(lián)合療法、新的生物標(biāo)記物和抑制性受體被提出來指導(dǎo)我們的診斷、預(yù)后和治療方法，需要更復(fù)雜的臨床前模型來提供可靠的功能應(yīng)用和更有效的評估。

微流控設(shè)備的使用保持了患者腫瘤準(zhǔn)確的生理性和特征，三維培養(yǎng)與微流控技術(shù)相結(jié)合來模擬腫瘤－免疫動力學(xué)以評估藥物療效，有可能減少藥物開發(fā)的時間和成本。此外，微流控設(shè)備可以進(jìn)行多組學(xué)研究和實(shí)時成像分析，這將有助于研究腫瘤－免疫相互作用和抗藥性機(jī)制，以及識別和評估新型癌癥治療方法。綜上所述，腫瘤微環(huán)境的微流控建模有望被納入臨床實(shí)踐，以推進(jìn)癌癥免疫治療和精確醫(yī)學(xué)。

參考文獻(xiàn)：

1．Goingwith the Flow： Modeling the Tumor Microenvironment Using MicrofluidicTechnology． Cancers （Basel）． 2021 Dec； 13（23）： 6052．

       原文標(biāo)題 : 微流控技術(shù)在腫瘤免疫領(lǐng)域的應(yīng)用前景