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文章背景簡介  

BACKGROUND INTRODUCTION

無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)（The cell－free protein synthesis system，CFPS）是一種以外源mRNA或DNA為模板，在細(xì)胞抽提物的酶系中補充底物和能量來合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的體內(nèi)重組表達(dá)系統(tǒng)相比，體外無細(xì)胞合成系統(tǒng)具有多種優(yōu)點，例如：步驟相對簡單、可表達(dá)對細(xì)胞有毒害作用或含有非天然氨基酸（如D－氨基酸）的特殊蛋白質(zhì)、能夠直接以PCR產(chǎn)物作為模板同時平行合成多種蛋白質(zhì)、便于開展高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究……等。

細(xì)胞與無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的比較（Khambhati K，  et al．  Frontiersin Bioengineering and Biotechnology， 2019， ）

2020年6月，美國加利福尼亞大學(xué)Luis E． Contreras－Llano等人在《Nature Communications 》（IF＝14．919）雜志上發(fā)表了題為“Holistic engineering of cell－free systems through proteome－reprogramming synthetic circuits”的文章，本文章研究強(qiáng)調(diào)了整體合成生物學(xué)方法在提高局部合成模塊性能方面的實用性和潛力，證明了重組蛋白質(zhì)是宿主細(xì)胞中翻譯機(jī)制過度表達(dá)的直接結(jié)果。此外，還表明了在源菌株中使用質(zhì)粒系統(tǒng)不會導(dǎo)致無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)（CFPS）的活性降低。

文章中，作者利用合成模塊來表達(dá)大腸桿菌核心翻譯機(jī)器的全部或子集的34種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被裂解并用于CPFS中的多株大腸桿菌BL21（DE3）中。選擇在多個菌株中進(jìn)行蛋白質(zhì)過表達(dá)是為了減少蛋白質(zhì)表達(dá)和質(zhì)粒維護(hù)造成的代謝負(fù)擔(dān)。質(zhì)粒維護(hù)造成的負(fù)擔(dān)表現(xiàn)為生長速度下降，這反過來又產(chǎn)生了較低濃度的核糖體和其他翻譯機(jī)器蛋白。這已被證明是高效CFPS的一個限制因素。作者假設(shè)，翻譯機(jī)器的過度表達(dá)應(yīng)在兩個方面有利于CFPS。首先，它應(yīng)該通過提供翻譯因子來補償增加的代謝負(fù)擔(dān)。其次，它應(yīng)該將全部蛋白質(zhì)組轉(zhuǎn)變到一個類似于高生長率的狀態(tài)，其中翻譯因子被富集，細(xì)胞達(dá)到蛋白質(zhì)合成效率的峰值。作者研究了兩個不同的微生物聯(lián)合體，一個有18個菌株（BL－18S），另一個有7個菌株（BL－7S），以獲得富集翻譯機(jī)器的細(xì)胞裂解物，而不需要純化和補充單個蛋白質(zhì)。為了研究標(biāo)準(zhǔn)CFPS反應(yīng)中增加的翻譯因子的影響，作者純化了BL－18S中過表達(dá)的翻譯機(jī)制蛋白，并將其補充為BL－E。deGFP的表達(dá)水平隨著翻譯機(jī)制的增加而成比例地增加。這些結(jié)果表明，蛋白質(zhì)濃度的增加并不是導(dǎo)致多菌株CFPS系統(tǒng)蛋白質(zhì)表達(dá)增加的唯一因素。此外，作者還通過質(zhì)譜分析了幾種全細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)組成。

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所用到的主要方法

METHODS  

CFPS系統(tǒng)反應(yīng)

deGFP表達(dá)定量分析

半連續(xù)交換反應(yīng)

質(zhì)譜分析

透射電子顯微鏡觀

SDS－PAGE

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

合成生物學(xué)專注于結(jié)合宿主細(xì)胞操作的基因工程模塊。為增強(qiáng)合成模塊的功能，可以對宿主蛋白質(zhì)組進(jìn)行重編程改造。在這里，作者將整體合成生物學(xué)的概念應(yīng)用到無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)工程中，利用細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)之間的聯(lián)系，創(chuàng)造一個更有利于蛋白質(zhì)合成的環(huán)境。具體來說，作者發(fā)現(xiàn)表達(dá)翻譯機(jī)制的局部模塊可以重新編程細(xì)菌蛋白質(zhì)組，改變700多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。由此產(chǎn)生的反饋產(chǎn)生了一個無細(xì)胞系統(tǒng)，可以合成熒光檢測基因、蛋白質(zhì)納米膠囊和基因編輯核酸酶Cas9，其表達(dá)水平比傳統(tǒng)的無細(xì)胞系統(tǒng)高5倍。作者的研究用到了一種整體方法，該方法將合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)整合在一起，實現(xiàn)了僅通過局部代謝途徑無法實現(xiàn)的結(jié)果。

       原文標(biāo)題 : 通過蛋白質(zhì)組重編程，對無細(xì)胞合成生物學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行整體工程設(shè)計