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前言

在過(guò)去十年中，我們?cè)谔岣逤AR－T細(xì)胞療法的療效方面取得了顯著進(jìn)展。然而，其臨床益處仍然有限，尤其是在實(shí)體腫瘤中。即使在血液腫瘤中，由于多種因素，對(duì)CAR－T療法有反應(yīng)的患者仍有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。這是由于T細(xì)胞特別是CAR－T細(xì)胞在癌癥中經(jīng)常出現(xiàn)功能障礙，許多逃避機(jī)制損害了抗腫瘤免疫。

與功能失調(diào)的T細(xì)胞相比，功能性T細(xì)胞在抗原刺激下表現(xiàn)出一系列活性，包括（1）擴(kuò)增；（2） 分泌效應(yīng)細(xì)胞因子（如IL－2、IFN－γ、TNF－α、穿孔素和顆粒酶）并裂解靶細(xì)胞；（3） 去除抗原刺激后依然存活；（4）在二次抗原激發(fā)時(shí)依然有上述反應(yīng)。可以認(rèn)為，如果以上至少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)不符合，T細(xì)胞就被認(rèn)為是功能失調(diào)的。

目前，研究最多的T細(xì)胞功能失調(diào)狀態(tài)是耗竭，其特征是功能性T細(xì)胞的所有上述特性喪失。另一種類(lèi)型的功能障礙是T細(xì)胞衰老，當(dāng)T細(xì)胞在保持細(xì)胞毒性能力的同時(shí)永久性地停止其細(xì)胞周期和增殖時(shí)，就會(huì)發(fā)生衰老。

T細(xì)胞功能失調(diào)是CAR－T療法發(fā)展的一個(gè)重大障礙，這是從細(xì)胞制造步驟開(kāi)始就遇到的問(wèn)題。包括CAR的設(shè)計(jì)和體外操作以及培養(yǎng)條件，都可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，工程化CAR－T細(xì)胞以提高其存活率并逆轉(zhuǎn)或防止耗竭表型可能會(huì)改善CAR－T細(xì)胞的治療。迄今為止，一些研究已經(jīng)采取了一些限制和創(chuàng)造抗耗竭T細(xì)胞的方法，并在幾個(gè)關(guān)鍵的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試。這些方法可能改善CAR－T細(xì)胞的功能障礙問(wèn)題，為患者帶來(lái)希望。

T細(xì)胞耗竭

T細(xì)胞耗竭與抗原的持續(xù)驅(qū)動(dòng)作用息息相關(guān)。在急性感染的狀態(tài)下，幼稚的CD8＋T細(xì)胞分化為短命效應(yīng)細(xì)胞（SLEC）或記憶前體效應(yīng)細(xì)胞（MPEC）。在抗原清除后，大多數(shù)SLEC死亡，而MPEC存活形成記憶性CD8＋T細(xì)胞，形成長(zhǎng)期保護(hù)性免疫。

而在慢性感染下，觀察到高親和力抗原特異性的CD8＋T細(xì)胞分化為SLEC迅速清除，死亡，但沒(méi)有形成MPEC亞群。相反，針對(duì)低抗原親和力的CD8＋T細(xì)胞擴(kuò)增、耗竭，表現(xiàn)為增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子產(chǎn)生的顯著減少，并在對(duì)抗持久性抗原的僵持中死亡。

慢性病毒感染和癌癥的一個(gè)共同特征就是，兩者都是以抗原的持久性作用為特征的長(zhǎng)期疾病。針對(duì)腫瘤抗原的幼稚CD8＋T細(xì)胞首先在外周淋巴組織啟動(dòng)，產(chǎn)生具有自我更新特性的干細(xì)胞樣PD－1loCD8＋T細(xì)胞，在趨化因子CCL5和CXCL9的作用下，向TME遷移并形成具有效應(yīng)作用的PD－1loCD8＋Tex。然而，TME中持續(xù)的抗原負(fù)荷最終迫使這些細(xì)胞持續(xù)分化為喪失功能的PD－1hiCD8＋Tex。PD－1hi狀態(tài)伴隨著協(xié)同抑制受體表達(dá)的增強(qiáng)（包括Tim－3、LAG－3、CD160、2B4、TIGIT和CTLA－4）以及效應(yīng)器功能的逐漸喪失。一旦CD8＋Tex進(jìn)入PD－1hi狀態(tài)，表觀遺傳會(huì)強(qiáng)制阻止去分化回到功能性干細(xì)胞樣和效應(yīng)器樣PD－1lo狀態(tài)。ICB（例如，抗PD－1）促進(jìn)的抗腫瘤反應(yīng)僅來(lái)自淋巴或腫瘤內(nèi)PD－1loCD8＋Tex亞群的擴(kuò)增，功能低下、ICB抵抗的PD－1hiCD8＋Tex最終會(huì)凋亡。

腫瘤和慢性病毒特異性CD8＋T細(xì)胞都具有與TCR信號(hào)相關(guān)基因的顯著富集（Batf、Egr2、Ezh2、Irf4、Nfatc1、Nfatc2、Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3）。這一觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了抗原的持久性參與是耗竭的主要驅(qū)動(dòng)因素。

T細(xì)胞衰老

細(xì)胞衰老是一個(gè)典型的多原因過(guò)程，發(fā)生在多種細(xì)胞類(lèi)型中，以細(xì)胞周期停滯為特征。T細(xì)胞衰老和T細(xì)胞耗竭是兩個(gè)截然不同的過(guò)程，衰老細(xì)胞表現(xiàn)出特定的衰老相關(guān)分泌表型（SASP），對(duì)其他細(xì)胞產(chǎn)生旁分泌影響。衰老的T細(xì)胞往往表現(xiàn)為CD45RA＋CD27?CD28?KLRG1＋CD57＋表型，它們失去增殖和分泌IL－2的能力，但表達(dá)細(xì)胞溶解分子、IFN－γ和TNF－α，并在體外具有細(xì)胞毒性。

T細(xì)胞衰老通常與DNA損傷反應(yīng)（DDR）的激活有關(guān)，DDR由端粒侵蝕、活性氧（ROS）引起的DNA損傷、葡萄糖或生長(zhǎng)因子剝奪以及cAMP途徑激活觸發(fā)。衰老T細(xì)胞表現(xiàn)出p38活化和活性氧積累增加、線(xiàn)粒體活性受損、mTOR信號(hào)下調(diào)和端粒縮短。盡管經(jīng)歷了細(xì)胞周期阻滯，但這些細(xì)胞仍具有細(xì)胞毒性，與末端效應(yīng)T細(xì)胞相似。

此外，慢性感染或自身免疫性疾病期間的反復(fù)激活也與T細(xì)胞衰老有關(guān)。腫瘤誘導(dǎo)的衰老T細(xì)胞已被證明可以抑制腫瘤微環(huán)境中其他T細(xì)胞的活性。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤誘導(dǎo)T細(xì)胞衰老是一種逃避機(jī)制。

CAR－T細(xì)胞功能障礙的機(jī)制

經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR－T細(xì)胞與未經(jīng)修飾的T細(xì)胞表現(xiàn)出類(lèi)似的功能障礙機(jī)制。事實(shí)上，從同一荷瘤小鼠分離的CD8＋CAR－T細(xì)胞和TIL具有相似的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)特征。已知有助于T細(xì)胞功能障礙的靶向通路可能改善CAR－T細(xì)胞功能。

CAR的設(shè)計(jì)

細(xì)胞外CAR結(jié)構(gòu)域的類(lèi)型、連接單鏈抗體與跨膜結(jié)構(gòu)域的間隔區(qū)類(lèi)型以及構(gòu)成CAR的共刺激結(jié)構(gòu)域已被證明對(duì)T細(xì)胞功能和持久性有深遠(yuǎn)影響。臨床試驗(yàn)中使用的大多數(shù)CAR來(lái)源于小鼠，這可能導(dǎo)致體液和CD8＋T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫排斥。

CAR的親和力影響強(qiáng)直信號(hào)，對(duì)靶細(xì)胞過(guò)強(qiáng)的親和力可能導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。一項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了一種CAT－CAR（CD19單鏈抗體），其與CD19的親和力比從傳統(tǒng)的CAR低40倍。該結(jié)構(gòu)在復(fù)發(fā)或難治性?xún)和疊LL患者中進(jìn)行了測(cè)試，臨床研究發(fā)現(xiàn)，14例CAR－T細(xì)胞擴(kuò)增增加的患者中有11例表現(xiàn)出持續(xù)性。

此外，共刺激域在CAR－T細(xì)胞的持久性和有效性中也起著關(guān)鍵作用，共刺激分子包括CD28、ICOS、CD27、4－1BB、OX40和CD40L。幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，配備4－1BB結(jié)構(gòu)域而非CD28結(jié)構(gòu)域的CAR結(jié)構(gòu)中的T細(xì)胞持久性增強(qiáng)。其他研究報(bào)告，含有4－1BB的CAR－T細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的記憶T細(xì)胞（TEM）表型，這可能延遲CAR－T細(xì)胞耗竭。ICOS屬于CD28共刺激分子家族，研究證明，CAR結(jié)構(gòu)中ICOS和4－1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的組合顯著增加T細(xì)胞的持久性。這些觀察結(jié)果表明，共刺激域的結(jié)構(gòu)是影響CAR－T細(xì)胞持久性的重要因素。

體外操作

制造T細(xì)胞的過(guò)程需要從患者身上獲取足夠數(shù)量的健康T細(xì)胞。然而，可能在從老年患者或經(jīng)化療／全身照射預(yù)處理的患者獲得衰老的T細(xì)胞。尤其是那些含有氯法拉濱或阿霉素的化療，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少會(huì)使最終的CAR－T細(xì)胞質(zhì)量不理想，用于輸注的T細(xì)胞類(lèi)型嚴(yán)重影響治療的效果。

事實(shí)上，通過(guò)使CD4／CD8比率正常化或使用幼稚或記憶細(xì)胞亞群，在臨床前模型中獲得了更好的持久性。幾項(xiàng)研究表明，使用早期譜系細(xì)胞富集的T細(xì)胞群能夠更好地?cái)U(kuò)增，并提高CAR－T細(xì)胞治療的持久性和療效。此外，多項(xiàng)研究表明，在制造過(guò)程中向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加抗氧化劑，如N－乙酰半胱氨酸，也可抑制效應(yīng)器分化并促進(jìn)TSCM細(xì)胞的擴(kuò)增。

免疫抑制微環(huán)境

在TME中，髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制細(xì)胞因子的存在會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。

慢性暴露于抗原也可導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭，如果抗原刺激持續(xù)存在，T細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列表觀遺傳、代謝和轉(zhuǎn)錄改變，出現(xiàn)耗竭狀態(tài)的表征。這種過(guò)程以遞進(jìn)的方式發(fā)生，IL－2和TNF－α在早期丟失，IFN－γ和趨化因子分泌在耗竭進(jìn)展后期減少。盡管高增殖能力也在早期喪失，但在體內(nèi)受到刺激時(shí)，耗竭的T細(xì)胞仍能有限增殖。耗竭的細(xì)胞也表現(xiàn)出抑制性受體的高表達(dá)，如PD－1、TIM－3、LAG－3、CD160、BTLA、CTLA－4和TIGIT。

改善CAR－T細(xì)胞功能障礙的策略

表達(dá)細(xì)胞因子及其受體

第四代CAR T細(xì)胞最近被開(kāi)發(fā)出來(lái)，用于抵抗TME中的免疫抑制環(huán)境，同時(shí)克服免疫耗竭。TRUMKS設(shè)計(jì)將CAR－T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能與具有免疫調(diào)節(jié)能力的細(xì)胞因子的原位遞送結(jié)合起來(lái)。在誘導(dǎo)系統(tǒng)的作用下，在CAR結(jié)合抗原后，細(xì)胞因子被合成，并以自分泌方式發(fā)揮作用，以增加T細(xì)胞的存活和擴(kuò)增。細(xì)胞因子也可以旁分泌方式發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)周?chē)�環(huán)境，干擾TME中存在的免疫抑制細(xì)胞因子。包括IL－12、IL－7、IL－15、IL－18、IL－21和IL－23在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子目前正在研究中，并已進(jìn)入早期臨床試驗(yàn)階段。

IL－12是一種促炎癥細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)Th1CD4＋T細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)CD8＋克隆擴(kuò)增和持續(xù)存在。它還負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)CTL和自然殺傷（NK）細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，重新激活無(wú)能的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，招募NK細(xì)胞，并抑制Treg。對(duì)結(jié)構(gòu)性表達(dá)IL－12的CD19－CAR－T細(xì)胞的臨床前研究表明，它增強(qiáng)了腫瘤殺傷效果和針對(duì)癌癥抗原的免疫記憶。然而，與IL－12相關(guān)的潛在致命毒性使得有必要開(kāi)發(fā)一種誘導(dǎo)系統(tǒng)，僅在CAR激活時(shí)限制IL－12的分泌。一些臨床研究（NCT02498912、NCT03932565和NCT03542799）正在進(jìn)行和招募中。

IL－15是一種刺激CD8＋T細(xì)胞和NK細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞因子。IL－18增加Th1細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)抑制IL－10的合成。IL－15和IL－18都是免疫反應(yīng)的增強(qiáng)劑，已經(jīng)在CAR－T細(xì)胞上進(jìn)行了測(cè)試。與傳統(tǒng)的CAR－T細(xì)胞相比，分泌IL－18和IL－15的CAR－T細(xì)胞在荷瘤小鼠中顯示出增強(qiáng)的擴(kuò)張性和持久性，并且在體外和體內(nèi)顯示出增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性。目前正在招募多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，使用工程化T細(xì)胞和NK細(xì)胞測(cè)試IL－15和IL－18分泌的CAR在實(shí)體瘤和血液瘤中的作用。

最近的研究表明，在同一個(gè)CAR－T細(xì)胞中共同表達(dá)多種細(xì)胞因子是可能的。NCT04833504是最近完成的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中在復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞淋巴瘤患者中檢測(cè)表達(dá)IL－7和CCL19的CD19＋CART細(xì)胞，但結(jié)果尚未報(bào)道。目前正在招募另外兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)，以檢測(cè)表達(dá)IL－7的CAR－T細(xì)胞與PD－1阻斷劑或其他細(xì)胞因子的分泌相結(jié)合。

聯(lián)合檢查點(diǎn)阻斷療法

通過(guò)抑制檢查點(diǎn)信號(hào)減少耗竭的策略包括通過(guò)shRNA表達(dá)載體或CRISPR／Cas9敲除共抑制分子。許多研究報(bào)告，阻斷檢查點(diǎn)抑制可恢復(fù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生并促進(jìn)CAR－T細(xì)胞存活。此外，同時(shí)阻斷多個(gè)免疫檢查點(diǎn)，如PD－1、TIM－3和LAG－3，可協(xié)同增加CAR－T細(xì)胞的效應(yīng)器功能。

將CAR－T細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)阻斷療法相結(jié)合可能是增強(qiáng)抗腫瘤活性、持久性和記憶細(xì)胞形成的有效策略。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌細(xì)胞系中，抗PD－1抗體增強(qiáng)了抗HER2 CAR－T細(xì)胞的抗腫瘤活性。然而，一些臨床試驗(yàn)報(bào)告，在使用PD－1抑制劑和抗GD2 CAR－T細(xì)胞聯(lián)合治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者后，結(jié)果為陰性。

此外，一些研究已經(jīng)采用其他策略來(lái)阻斷PD－1，例如基因編輯以使CAR－T細(xì)胞分泌PD－1阻斷抗體或下調(diào)PD－1。

使用干性T細(xì)胞

效應(yīng)T細(xì)胞最初被認(rèn)為是ACT的最佳產(chǎn)品，因?yàn)樗鼈兙哂袣⑺滥[瘤細(xì)胞的功效。然而，它們的持久性有限，并且擴(kuò)增能力很差，很容易發(fā)生耗竭。

TSCM由于其壽命長(zhǎng)、自我更新能力強(qiáng)以及在不同T細(xì)胞群中的分化能力，是ACT的理想候選。臨床研究表明，輸注表型和功能性TSCM樣CAR－T細(xì)胞（CD62L＋、CD28＋和CD27＋）可產(chǎn)生良好的結(jié)果。例如，使用抗CD－19 CAR－T細(xì)胞治療的CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者顯示出與CD27＋CD45RO?CD8細(xì)胞群相關(guān)的良好反應(yīng)。此外，對(duì)小鼠的研究表明，注入富含CD62L＋的T細(xì)胞群可增加擴(kuò)增和持久性，從而導(dǎo)致持久的腫瘤消退。

小結(jié)

盡管在過(guò)去十年中CAR－T細(xì)胞治療取得了顯著進(jìn)展，然而CAR－T細(xì)胞在患者體內(nèi)可能發(fā)生的功能障礙導(dǎo)致有限的持久性依然是一個(gè)挑戰(zhàn)，主要原因是T細(xì)胞耗竭和衰老。通過(guò)對(duì)CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，改變生產(chǎn)條件，或引入新的治療方法，我們可能創(chuàng)造抗耗竭的工程化T細(xì)胞，從而進(jìn)一步擴(kuò)大CAR－T細(xì)胞的臨床應(yīng)用。盡管迄今為止的結(jié)果仍然有限，但可能性是無(wú)窮的，突破可能即將到來(lái)。

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       原文標(biāo)題 : CAR-T細(xì)胞功能障礙的機(jī)制和調(diào)整策略