前言

過(guò)繼性免疫治療是血液學(xué)的一種變革性治療方法，它通過(guò)基因工程在T細(xì)胞表達(dá)合成嵌合抗原受體（CAR）。針對(duì)B細(xì)胞白血病和淋巴瘤中的CD19抗原的CAR－T細(xì)胞已得到臨床認(rèn)可，目前成為全球范圍癌癥中心實(shí)施的“常規(guī)”治療手段。在血液學(xué)和腫瘤學(xué)的其他適應(yīng)癥中，識(shí)別和驗(yàn)證新的CAR靶抗原，提高療效和降低與CAR－T細(xì)胞治療相關(guān)的毒性，以及促進(jìn)CAR－T細(xì)胞的生產(chǎn)以增加患者的適用性，在轉(zhuǎn)化研究方面正在做著巨大的努力。這里介紹了一系列新的靶點(diǎn)和技術(shù)，這些新靶點(diǎn)和新技術(shù)說(shuō)明了研究者正在努力使CAR－T細(xì)胞療法成為癌癥醫(yī)學(xué)中普遍適用和有效的治療方法。

CAR－T細(xì)胞的新靶點(diǎn)  

血液惡性腫瘤：在血液學(xué)中，新靶點(diǎn)最豐富的管線是多發(fā)性骨髓瘤。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化分子（SLAM）家族的一些成員正被作為潛在的靶點(diǎn)，包括SLAMF7（別名：CD319，CRACC，CS－1）和SLAMF3（別名：CD229，Ly9）。SLAMF7和SLAMF3在未治療和耐化療的多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細(xì)胞上均勻表達(dá)，靶向任一抗原的CAR－T細(xì)胞在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出高效的殺傷作用。因此，SLAMF7 CAR－T細(xì)胞目前正在進(jìn)入臨床試驗(yàn)。SLAMF7在一些正常淋巴細(xì)胞亞群的一小部分細(xì)胞上表達(dá)，其結(jié)果是在CAR－T細(xì)胞制造過(guò)程中SLAMF7高表達(dá)T細(xì)胞發(fā)生自噬，因此，可能會(huì)在SLAMF7 CAR－T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移后發(fā)生SLAMF7高表達(dá)淋巴細(xì)胞的選擇性缺失。令人鼓舞的是，抗SLAMF7抗體的臨床經(jīng)驗(yàn)表明，患者保留淋巴細(xì)胞總數(shù)而不增加感染率。相比之下，SLAMF3在T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞上的表達(dá)是一致的，這表明SLAMF3可能會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞耗竭，但目前尚無(wú)針對(duì)SLAMF3的臨床經(jīng)驗(yàn)。下表提供了多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞和T細(xì)胞惡性腫瘤以及急性髓性白血�。ˋML）中CAR－T細(xì)胞的一些其他新靶向抗原。

G蛋白偶聯(lián)受體C型第5組成員D（GPRC5D）被發(fā)現(xiàn)是多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中mRNA篩選活動(dòng)中高表達(dá)的基因，也是與不良臨床預(yù)后相關(guān)的一個(gè)因素。最近的一項(xiàng)研究顯示GPRC5D蛋白在原發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)，且GPRC5D特異性CAR－T細(xì)胞具有抗多發(fā)性骨髓瘤作用。此外，該研究確定毛囊是唯一可檢測(cè)到GPRC5D表達(dá)的正常組織。值得注意的是，聯(lián)合靶向BCMA和GPRC5D被證明可以防止BCMA逃逸的復(fù)發(fā)，說(shuō)明了這一概念在提高臨床療效和預(yù)后方面的潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

以往的研究報(bào)告了CD19 CAR－T細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤患者中的臨床療效，盡管在臨床病理學(xué)中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的常規(guī)分析，CD19在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上的檢測(cè)很少。超分辨顯微鏡分析表明，在一部分患者的原發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，CD19經(jīng)常表達(dá)，其分子密度足以觸發(fā)CD19 CAR－T細(xì)胞的識(shí)別。這些數(shù)據(jù)表明，先進(jìn)的成像技術(shù)可以用來(lái)指導(dǎo)患者和CAR－T產(chǎn)品的選擇，以及在治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)抗原的表達(dá)。

最近報(bào)道了幾種增加多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞靶抗原密度的有趣策略。小分子γ－分泌酶抑制劑（GSIs）被證明可以阻止多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的BCMA脫落，從而提高抗BCMA CAR－T細(xì)胞的療效。我們已經(jīng)證明，使用組蛋白去乙�；�酶（HDAC）抑制劑（例如，panobinostat、ricolinostat、下一代HDAC6抑制劑）的表觀遺傳調(diào)節(jié)可增強(qiáng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的CD38表達(dá)，從而增強(qiáng)抗CD38抗體的活性，這個(gè)概念目前正在多發(fā)性骨髓瘤CAR－T細(xì)胞靶向抗原上進(jìn)行測(cè)試。

實(shí)體瘤：長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直致力于用幾種典型靶抗原（例如TAG－72、FR（葉酸受體）、CEA（NCT00004178）、GD2（NCT00085930）、CD171（NCT00006480）和IL13RA2（NCT00730613））來(lái)評(píng)估實(shí)體瘤中的CAR－T細(xì)胞的治療效果。這些試驗(yàn)大多使用的還是與現(xiàn)在的標(biāo)準(zhǔn)相比，技術(shù)上不太先進(jìn)的CAR－T產(chǎn)品和生產(chǎn)工藝。自那時(shí)以來(lái)，提高療效的一個(gè)方向就是改進(jìn)載體和制造技術(shù)，包括尋找在腫瘤細(xì)胞上均質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)的替代靶抗原（理想情況下具有病理生理相關(guān)性以降低抗原丟失的風(fēng)險(xiǎn)）。目前，有幾種CAR－T細(xì)胞產(chǎn)品正在積極的進(jìn)行臨床試驗(yàn)或臨床前的后期開(kāi)發(fā)，例如GPC3、mesothelin、HER2、EGFRvIII、ROR1、CD171、B7－H3、整合素αvβ3、硫酸乙酰肝素Glypican－1、N端連接糖表位的Annexin A2、Claudin18．2，腫瘤限制性MUC1的裂解產(chǎn)物MUC1＊。

在最近的一項(xiàng)研究中，研究者發(fā)現(xiàn)了蝎毒氯毒素（CLTX）的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤結(jié)合能力，構(gòu)建了CLTX肽作為抗原結(jié)合部分的CAR－T細(xì)胞。CLTX－CAR－T細(xì)胞靶向依賴(lài)于靶細(xì)胞上MMP2的表達(dá)，并在異種移植模型中誘導(dǎo)腫瘤消退而無(wú)毒性反應(yīng)。此外，還有靶向表達(dá)在卵巢癌、睪丸癌和肺癌上的Claudin－6的CAR－T細(xì)胞。聯(lián)合應(yīng)用編碼靶抗原的RNA疫苗納米顆粒，促進(jìn)了CAR－T細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增和植入，從而在同源小鼠模型中導(dǎo)致腫瘤消退。CAR－T細(xì)胞也被靶向非經(jīng)典腫瘤抗原，如PD－L1或纖維結(jié)合蛋白剪接變體EIIIB，它們?cè)谀[瘤間質(zhì)和新生血管中表達(dá)。

此外，另一個(gè)方向是評(píng)估CAR－T細(xì)胞在聯(lián)合治療中的作用，這些聯(lián)合療法旨在中和腫瘤微環(huán)境（TME）中的抑制機(jī)制，并使用先進(jìn)的基因工程技術(shù)來(lái)增強(qiáng)CAR－T細(xì)胞的效力和壽命。

CAR－T細(xì)胞的新技術(shù)

提高功效的技術(shù)：T細(xì)胞衰竭已被確定為限制CAR－T細(xì)胞治療實(shí)體瘤療效的一個(gè)主要原因。為了構(gòu)建抗衰竭的CAR－T細(xì)胞，研究人員最近鑒定了關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，并顯示TOX和NR4A轉(zhuǎn)錄因子的缺失以及AP－1家族轉(zhuǎn)錄因子c－Jun的過(guò)度表達(dá)增加了小鼠腫瘤模型中的CAR－T細(xì)胞功能。

在TME中，許多抑制因子可能會(huì)阻礙CAR－T細(xì)胞的功能。通過(guò)CAR－T細(xì)胞產(chǎn)生抗PD1單鏈抗體、去掉PD－1和TGF－β受體、抑制TGF－β受體信號(hào)通路的抑制和表達(dá)主要的負(fù)調(diào)節(jié)TGF－β受體能夠?qū)�抗這些抑制性配體和可溶性因子，從而增強(qiáng)CAR－T細(xì)胞的功能。此外，通過(guò)在CAR－T細(xì)胞中表達(dá)主要的負(fù)性Fas受體，可減少來(lái)自TME的死亡信號(hào)。

引導(dǎo)CAR－T細(xì)胞主動(dòng)調(diào)節(jié)TME中的細(xì)胞因子環(huán)境是另一種增強(qiáng)療效的有效策略。最近有報(bào)道稱(chēng)，使CAR－T細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL）15，或IL－15和IL－21或IL－23的聯(lián)合通過(guò)自分泌機(jī)制可以提高CAR－T細(xì)胞的持久性和抗腫瘤能力。對(duì)于產(chǎn)生IL－18的CAR－T細(xì)胞或通過(guò)溶瘤病毒向腫瘤靶向輸送IL－2和TNF－a也觀察到類(lèi)似的效果，兩者都具有參與先天性和內(nèi)源性適應(yīng)性免疫反應(yīng)的額外效果。同樣，在CAR－T細(xì)胞上表達(dá)CD40L可以使抗原呈遞細(xì)胞招募內(nèi)源性腫瘤靶向T細(xì)胞。

CAR－T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腫瘤部位的減少可能是由于CAR－T細(xì)胞上趨化因子受體的錯(cuò)配和腫瘤中異常表達(dá)的趨化因子引起的。因此，為了促進(jìn)向腫瘤的輸送，可以將CAR－T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表達(dá)與特定腫瘤的趨化因子譜相匹配的趨化因子受體。CCR2b的表達(dá)允許CAR－T細(xì)胞向表達(dá)CCL2的腫瘤遷移。同樣，最近的一項(xiàng)研究將IL－8受體表達(dá)與CXCR1或CXCR2結(jié)合起來(lái)，以增加CAR－T細(xì)胞的持續(xù)性和向腫瘤部位的輸送能力。此外，可以想象的是，這些策略中的一些可以結(jié)合起來(lái)，以“定制”CAR－T細(xì)胞產(chǎn)品，以適應(yīng)每個(gè)腫瘤實(shí)體的具體情況。

提高安全性的技術(shù)：細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）是一種全身炎癥反應(yīng)，也是CAR－T細(xì)胞治療最常見(jiàn)的急性毒性反應(yīng)。有幾個(gè)因素會(huì)影響CRS的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，包括腫瘤負(fù)荷、CAR－T細(xì)胞劑量、體內(nèi)擴(kuò)增和淋巴細(xì)胞消耗的調(diào)節(jié)。CRS和神經(jīng)毒性的臨床管理概念繼續(xù)得到完善，并有助于降低發(fā)病率和死亡率。然而，CRS仍然是病人住院和重癥監(jiān)護(hù)的主要原因，限制了CAR－T細(xì)胞治療的可用性。

最近的一個(gè)重要進(jìn)展是小鼠模型的發(fā)展，這些模型能夠再現(xiàn)CRS的臨床特征和神經(jīng)毒性，并被用于從機(jī)理上深入了解CRS的病理生理學(xué)，并評(píng)估干預(yù)策略。在NSGSGM模型中，小鼠被植入人類(lèi)造血干細(xì)胞，以提供“內(nèi)源性”髓細(xì)胞，這些細(xì)胞在CRS發(fā)展的惡性循環(huán)中至關(guān)重要，并產(chǎn)生CRS主導(dǎo)細(xì)胞因子IL－6和IL－1。在這個(gè)模型中，使用臨床認(rèn)可的IL－6受體拮抗劑（IL－6RA）可以阻止顯性CRS的發(fā)展，但未能預(yù)防神經(jīng)毒性。這提供了這樣一個(gè)假設(shè)，即IL－1分泌是CRS發(fā)生的關(guān)鍵事件，事實(shí)上，IL－1受體拮抗劑anakinra的治療能夠控制CRS，并防止致命的神經(jīng)毒性。在CD19 CAR－T治療中使用Anakinra預(yù)防CRS和神經(jīng)毒性的II期研究正在進(jìn)行中（NCT04148430）。同樣，在異種移植小鼠模型中，聯(lián)合應(yīng)用抗GM－CSF抗體lenzilumab增強(qiáng)了CAR－T細(xì)胞的抗腫瘤活性，減少了CRS和神經(jīng)炎癥。

此外，研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑（TKI）達(dá)沙替尼通過(guò)阻斷LCK干擾CAR信號(hào)，誘導(dǎo)CAR－T細(xì)胞快速啟動(dòng)功能關(guān)閉狀態(tài)，表現(xiàn)為細(xì)胞溶解活性和細(xì)胞因子分泌停止。為了證明在體內(nèi)對(duì)CAR－T細(xì)胞進(jìn)行“遠(yuǎn)程控制”的能力，研究者使用達(dá)沙替尼作為藥理學(xué)關(guān)閉開(kāi)關(guān)，以防止小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子分泌和CRS的發(fā)展。有趣的是，達(dá)沙替尼的抑制作用是迅速和完全可逆的，為急性和短暫控制提供了機(jī)會(huì)，而不終止CAR－T產(chǎn)品，正如觸發(fā)自殺開(kāi)關(guān)的情況一樣（例如誘導(dǎo)型caspase 9），或通過(guò)共表達(dá)表面標(biāo)記物（如tEGFR）進(jìn)行抗體為基礎(chǔ)的清除。

另一個(gè)最近提出的策略是設(shè)計(jì)一個(gè)包含異二聚體目標(biāo)識(shí)別和信號(hào)結(jié)構(gòu)域的剎車(chē)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)域在使用高親和力小分子藥物時(shí)會(huì)被破壞。在有藥物的情況下，剎車(chē)結(jié)構(gòu)是失活的。一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這種小分子藥物特異性地針對(duì)這種特殊的剎車(chē)結(jié)構(gòu)，缺點(diǎn)是這種藥物仍然需要經(jīng)過(guò)正式的臨床開(kāi)發(fā)和批準(zhǔn)。除了短暫的控制毒性作用外，這兩種策略還可以協(xié)調(diào)性地用于防止慢性的CAR信號(hào)，這是導(dǎo)致CAR－T細(xì)胞衰竭的關(guān)鍵因素。

通過(guò)表達(dá)考慮多種抗原的“智能”CAR設(shè)計(jì)，提高CAR－T細(xì)胞的能力以區(qū)分腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞的研究日益增加。一個(gè)先進(jìn)的概念是使用合成notch（SynNotch）受體，該受體包含針對(duì)特定靶點(diǎn)的細(xì)胞外抗原識(shí)別域。靶點(diǎn)連接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的釋放，該轉(zhuǎn)錄因子遷移到細(xì)胞核以誘導(dǎo)次級(jí)CAR基因的表達(dá)。在最近的一個(gè)應(yīng)用中，B7－H3或EpCAM特異性SynNotch受體被用來(lái)誘導(dǎo)ROR1特異性CAR的表達(dá)。這項(xiàng)研究顯示了提高腫瘤細(xì)胞選擇性和防止對(duì)健康組織毒性的潛力。然而，SynNotch的概念仍然受到notch受體的自發(fā)釋放和在T細(xì)胞表面表達(dá)次級(jí)CAR的時(shí)間延遲的困擾，SynNotch CAR－T細(xì)胞的有效性和安全性尚待臨床證明。

基因工程與制造技術(shù)的提升：最近兩個(gè)特別值得注意的進(jìn)展是利用Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和CRISPR－Cas9基因組編輯技術(shù)改進(jìn)了無(wú)病毒基因轉(zhuǎn)移，使CAR轉(zhuǎn)基因具有針對(duì)性的基因組插入。Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座酶的設(shè)計(jì)變體的開(kāi)發(fā)可以通過(guò)一個(gè)小循環(huán)DNA轉(zhuǎn)座子共同轉(zhuǎn)化T細(xì)胞，從而促進(jìn)了無(wú)病毒過(guò)程中可擴(kuò)展、快速和可出口的制造。先前的研究已經(jīng)證明了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的CAR表達(dá)的潛力，并建立了第一個(gè)用于Sleeping Beauty CAR－T細(xì)胞的臨床安全性研究。歐洲首個(gè)關(guān)于Sleeping Beauty CAR－T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)最近獲得批準(zhǔn)，并將研究SLAMF7 CAR－T細(xì)胞對(duì)抗多發(fā)性骨髓瘤的療效（https：／／www．caramba－cart．eu）。將CAR（和T細(xì)胞受體，TCR）轉(zhuǎn)基因靶向插入內(nèi)源性TCR位點(diǎn)，目的是實(shí)現(xiàn)生理性的調(diào)節(jié)CAR表達(dá)以增強(qiáng)反應(yīng)性和防止耗竭。臨床使用CRISPR編輯的T細(xì)胞產(chǎn)品的一個(gè)關(guān)鍵要求是仔細(xì)注釋非靶向基因，以評(píng)估遺傳毒性的風(fēng)險(xiǎn)。

展望

在血液學(xué)和腫瘤學(xué)適應(yīng)癥中，CAR－T細(xì)胞的新靶抗原有著豐富的管線，同時(shí)也有新技術(shù)來(lái)提高CAR－T細(xì)胞治療的治療指數(shù)。有了這個(gè)“目標(biāo)和技術(shù)包”，我們有理由預(yù)期CAR－T細(xì)胞療法將在其他癌癥實(shí)體中完成其概念性的臨床實(shí)踐。

參考文獻(xiàn)：

New targets and technologies for CAR－T cells． Curr Opin Oncol． 2020 Sep；32（5）：510－517．