免疫學(xué)：

　　免疫學(xué)功能：免疫就是識(shí)別自我和非我，保持自我穩(wěn)態(tài)的一門學(xué)問(wèn)。自我的復(fù)雜度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于非我。

　　VDJ含義：

　　V：variable 可變區(qū)

　　D：diversity 多樣性

　　J：joining 交聯(lián)區(qū)

　　免疫組庫(kù)（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定時(shí)間，某個(gè)個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細(xì)胞和T細(xì)胞的總和。免疫組庫(kù)測(cè)序（Immune Repertoire sequencing（IR－SEQ））是以 T／B 淋巴細(xì)胞為研究目標(biāo)，以多重PCR或5’RACE技術(shù)目的擴(kuò)增決定B細(xì)胞受體（BCR）或T細(xì)胞受體（TCR）多樣性的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，全面評(píng)估免疫系統(tǒng)的多樣性，深入挖掘免疫組庫(kù)與疾病的關(guān)系。

　　多樣性的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)）：

　　互補(bǔ)決定區(qū)是VL與VH均有3個(gè)HVR，它們共同組成Ig的抗原結(jié)合部位（antigen－binding site）。該部位因在空間結(jié)構(gòu)上可與抗原決定簇形成精密的互補(bǔ)，故超變區(qū)又稱互補(bǔ)性決定區(qū)（complementarity determining region，CDR）。整個(gè)抗體分子可分為恒定區(qū)和可變區(qū)兩部分。在可變區(qū)內(nèi)有一小部分氨基酸殘基變化特別強(qiáng)烈，這些氨基酸的殘基組成和排列順序更易發(fā)生變異區(qū)域稱高變區(qū)。在L鏈、H鏈的V區(qū)中有三個(gè)高變區(qū)（hypervariable regions，HVR），該部位因在空間結(jié)構(gòu)上可與抗原決定簇形成精密的互補(bǔ)，故高變區(qū)又稱互補(bǔ)性決定區(qū)。

　　TCR和BCR結(jié)構(gòu)

　　VDJ多樣性機(jī)制：

　　重排過(guò)程選擇的片段是隨機(jī)的， 隨機(jī)重排的結(jié)果可以產(chǎn)生種免疫球蛋白分子。其次， 淋巴細(xì)胞在成熟后還會(huì)發(fā)生體細(xì)胞突變， 又極大的增加了抗體的多樣性． 綜合來(lái)看， H鏈和L鏈可能的組合數(shù)預(yù)計(jì)可達(dá)以上。小鼠每天生成的淋巴細(xì)胞為個(gè)，可見(jiàn)動(dòng)物一生中還不可能使全部可能產(chǎn)生的基因組合得到表達(dá)。

　　基因重排發(fā)生在B細(xì)胞成熟前，體細(xì)胞高頻突變發(fā)生在B細(xì)胞成熟后。B細(xì)胞從干細(xì)胞發(fā)育成成熟的B細(xì)胞之前，要經(jīng)歷重鏈的VDJ基因重排和輕鏈的VJ基因重排；成熟的B細(xì)胞，遷移到外周淋巴器官之后，在外界抗原的刺激下，可能發(fā)生體細(xì)胞高頻突變（SHM）。

　　免疫應(yīng)答的基本過(guò)程：

　　為什么要做單細(xì)胞免疫組庫(kù)？

　　分子的多樣性決定了單細(xì)胞測(cè)序的優(yōu)勢(shì)：

　　揭示克隆性、多樣性、抗原特異性和細(xì)胞環(huán)境組裝并注釋全長(zhǎng)V（D）J基因序列從單個(gè)T細(xì)胞識(shí)別α和β鏈序列將來(lái)自單個(gè)B細(xì)胞的重鏈和輕鏈免疫球蛋白（Ig）序列以全同型分辨率配對(duì)同時(shí)測(cè)定同一細(xì)胞中TCR、B細(xì)胞Ig、細(xì)胞表面蛋白表達(dá)及5’基因表達(dá)配對(duì)TCRα和β鏈與TCR－pMHC特異性序列同時(shí)測(cè)定細(xì)胞表面蛋白和基因表達(dá)。

　　單細(xì)胞免疫組庫(kù)如何做？

　　2015年，10× Genomics發(fā)布了基于微流控和油滴包裹技術(shù)的Chromium單細(xì)胞系統(tǒng)平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)高通量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞V（D）J測(cè)序。不但可以將TCR／BCR雙鏈完美匹配，而且可以細(xì)化到單細(xì)胞水平，同時(shí)獲得表達(dá)譜信息。

　　BCR及TCR測(cè)序算法概述：

　　對(duì)組裝的每一個(gè)contig，我們利用CDR3s的側(cè)翼序列是保守的這一事實(shí)來(lái)搜索CDR3序列。我們將來(lái)自V和J參考片段的motifs與人類和小鼠進(jìn)行比較。

　　滿足下列條件，該條件被稱為“有生產(chǎn)力productive ”：

　　完整的長(zhǎng)度要求。重疊部分與V基因的起始部分匹配。該基因繼續(xù)延伸，最終與J基因的末端相匹配。

　　起始要求。V的起始部分匹配contig上的起始密碼子。注意，在10x提供的人類和小鼠參考序列中，每個(gè)V段都以一個(gè)起始密碼子開始。

　　連續(xù)性。在V開始和J結(jié)束之間沒(méi)有終止密碼子。

　　位置。J停止減去V開始等于1模3。這就是說(shuō)V和J段上的密碼子在坐標(biāo)系中。

　　CDR3上要求。有一個(gè)帶注釋的CDR3序列。＋結(jié)構(gòu)要求。設(shè)VJ為V段和J段長(zhǎng)度之和。讓len表示J停止減去V開始，在contig上測(cè)量，那么VJ － len在－25和＋25之間，除了IGH，它必須在－55和＋25之間。這個(gè)條件是為了防止不可能與功能蛋白相對(duì)應(yīng)的異常結(jié)構(gòu)變化。

　　主要應(yīng)用：

　　免疫組庫(kù)可以捕捉腫瘤發(fā)生時(shí)免疫微環(huán)境的變化，尋找免疫治療的靶點(diǎn)，從而輔助免疫治療更好的抗擊腫瘤。

　　器官或者骨髓移植時(shí)，經(jīng)常會(huì)誘發(fā)宿主排斥反應(yīng)的發(fā)生，從而發(fā)生慢性移植抗宿主病。

　　自身免疫免疫性疾病是由于機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。

　　免疫組庫(kù)在感染性疾病、抗體開發(fā)、用藥及疫苗評(píng)估等多個(gè)方面均有應(yīng)用價(jià)值。例如通過(guò)免疫組庫(kù)研究，可以檢測(cè)感染類疾病過(guò)程中的免疫動(dòng)態(tài)變化；

　　在抗體開發(fā)方面，可以獲得特征性的BCR（Ig）序列，縮短抗體開發(fā)的流程；也可以針對(duì)某種疾病用藥后的外周血樣本進(jìn)行評(píng)估，確認(rèn)藥物是否激發(fā)免疫反應(yīng)及其功效。

　　免疫治療領(lǐng)域的細(xì)胞檢測(cè)及監(jiān)測(cè)。

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