前言

當(dāng)免疫細(xì)胞遇到入侵的病原體時,它們能迅速激活強(qiáng)大的防御機(jī)制。然而,過度的免疫反應(yīng)可能會產(chǎn)生有害影響。免疫細(xì)胞在多個檢查點受到各種分子和具有抑制功能的細(xì)胞的調(diào)節(jié),這些檢查點對于自我耐受的發(fā)展至關(guān)重要。然而,這樣的檢查點可能會被腫瘤和病原體劫持,從而逃離免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。

以PD-1和CTLA-4為靶點的腫瘤免疫療法顯著改善了不同癌癥類型患者的預(yù)后,徹底改變了癌癥治療。這些治療方法的成功證實了抑制性共受體是免疫細(xì)胞不攻擊腫瘤細(xì)胞和自身組織的關(guān)鍵檢查點。然而,它們的應(yīng)答率通常較低,免疫相關(guān)不良事件(irAEs)也在使用免疫檢查點抑制劑的患者中出現(xiàn)。這表明需要繼續(xù)破譯抑制性共受體的復(fù)雜生物學(xué),以提高癌癥患者的響應(yīng)率并防止不必要的副作用。

迄今為止,除了PD-1和CTLA-4外,還發(fā)現(xiàn)了許多刺激性和抑制性的共受體。這些共受體通過調(diào)節(jié)抗原受體信號的質(zhì)量和數(shù)量來控制淋巴細(xì)胞的活化,從而在避免自身免疫和過度免疫反應(yīng)的同時優(yōu)化針對腫瘤和病原體的免疫反應(yīng)。在這些共受體中,淋巴細(xì)胞活化基因-3(LAG-3,CD223)是僅次于PD-1的首要靶點,目前正在進(jìn)行多項臨床試驗來驗證LAG-3靶向治療作用。

LAG-3的分子特性

1990年,Triebel和他的同伴在一項篩選中發(fā)現(xiàn)了LAG-3。LAG-3是一種Ⅰ型跨膜蛋白,具有四個Ig樣結(jié)構(gòu)域,稱為結(jié)構(gòu)域1到結(jié)構(gòu)域4(D1-D4)。LAG-3的胞外區(qū)與CD4的氨基酸同源性約為20%,CD4也由4個Ig樣結(jié)構(gòu)域組成。此外,在大多數(shù)物種中,LAG-3基因位于CD4基因附近,因此,這些基因很可能是通過基因復(fù)制進(jìn)化而來的。與細(xì)胞外區(qū)域的相似性相反,LAG-3和CD4的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域沒有明顯的相似性。LAG-3缺乏與淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶(Lck)相關(guān)所需的半胱氨酸基序和在CD4中觀察到的棕櫚�；�位點。

LAG-3的D1由9條β-鏈組成,它們被稱為A、B、C、C'、C”、D、E、F和G鏈。大約30個氨基酸的附加序列位于C和C'鏈之間,形成一個環(huán),稱為“額外環(huán)”。盡管序列相似性較低,但在人和小鼠LAG-3中都可以觀察到這個環(huán),據(jù)報道此環(huán)參與了LAG-3和主要組織相容性復(fù)合體II類(MHCII)之間的關(guān)聯(lián)。此外,LAG-3高度糖基化,在D2-D4中存在多個N-糖基化位點。Galectin-3和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞凝集素(LSECtin)被認(rèn)為與LAG-3聚糖存在相互作用。

與CD4相比,D4和跨膜區(qū)之間的LAG-3區(qū)有一個較長的氨基酸序列稱為“連接肽”。基于小鼠模型,Li等報道了金屬蛋白酶ADAM10和ADAM17在CP處裂解LAG-3,并以可溶性形式釋放LAG-3胞外區(qū)域。LAG-3突變體能夠逃避金屬蛋白酶的切割,表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。因此,ADAM10和ADAM17可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面LAG-3的數(shù)量來調(diào)節(jié)LAG-3的抑制作用。人與小鼠CP的氨基酸序列同源性較低。人類LAG-3是否也能被這些金屬蛋白酶裂解,還有待進(jìn)一步研究。目前,可溶性LAG-3的功能尚不清楚。

LAG-3的表達(dá)

與PD-1和CTLA-4一樣,LAG-3在原始T細(xì)胞上不表達(dá),但在抗原刺激下可在CD4+和CD8+T細(xì)胞上誘導(dǎo)表達(dá)。由于LAG-3的抑制功能與其在細(xì)胞表面的表達(dá)水平密切相關(guān), LAG-3表達(dá)的調(diào)節(jié)非常關(guān)鍵。長期感染病毒、細(xì)菌、寄生蟲引起抗原的持續(xù)暴露,會導(dǎo)致CD4+和CD8+T細(xì)胞上LAG-3以及其他抑制性共受體的高水平持續(xù)表達(dá)。這些T細(xì)胞失去強(qiáng)大的效應(yīng)器功能,被稱為衰竭性T細(xì)胞。LAG-3阻斷劑已被證明能使衰竭的T細(xì)胞恢復(fù)活力并增強(qiáng)抗感染免疫,盡管與PD-1阻斷劑相比,作用較小。腫瘤浸潤性T細(xì)胞也持續(xù)暴露于腫瘤相關(guān)抗原,并表達(dá)高水平的多種抑制共受體,包括LAG-3,導(dǎo)致功能衰竭。IL-2、IL-7和IL-12可增強(qiáng)活化T細(xì)胞的LAG-3表達(dá)。

LAG-3在具有抑制功能的CD4+T細(xì)胞亞群中也有表達(dá)。Foxp3+調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞結(jié)構(gòu)性地表達(dá)LAG-3。Zhang等人證明,LAG-3對Treg細(xì)胞的增殖具有內(nèi)在的限制作用。LAG-3在Treg細(xì)胞效應(yīng)器功能中的作用是有爭議的。Huang等人報告,LAG-3缺陷小鼠的Treg細(xì)胞以較低的效率抑制效應(yīng)T細(xì)胞的激活,而其他研究表明,LAG-3缺陷Treg細(xì)胞的抑制功能是可比的。需要進(jìn)一步的研究來闡明LAG-3與Treg細(xì)胞的實際作用。LAG-3在CD4+1型調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tr1)上也有表達(dá),Tr1細(xì)胞通過分泌大量的IL-10表現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫抑制活性。此外,表達(dá)LAG-3的CD4+CD25-Foxp3-T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β3,被認(rèn)為是一種獨特的細(xì)胞群,具有調(diào)節(jié)功能。有趣的是,目前也觀察到產(chǎn)生IL-10的自然調(diào)節(jié)漿細(xì)胞表達(dá)LAG-3,LAG-3在這些非經(jīng)典調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞外抑制功能中的作用尚不清楚,需要進(jìn)一步的研究。

已知多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,如胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)的高遷移率族蛋白盒(TOX)、活化T細(xì)胞核因子(NFAT)、核受體亞家族4A(NR4A)、干擾素調(diào)節(jié)因子4和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟蛋白-1參與產(chǎn)生衰竭的T細(xì)胞。其中,NFAT、NR4A和TOX被證明在T細(xì)胞中過度表達(dá)時,與其他抑制性共受體一起,可以增加LAG-3的表達(dá)水平。早期生長反應(yīng)基因2(EGR2)也被報道是誘導(dǎo)CD4+CD25-Foxp3-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中LAG-3表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。另一方面,T細(xì)胞中表達(dá)的T-box(T-bet)被報道抑制LAG-3和其他抑制性共受體的表達(dá),并維持慢性感染時CD8+T細(xì)胞的抗原特異性反應(yīng)。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控外,LAG-3的細(xì)胞表面表達(dá)水平還受亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運和蛋白水解裂解的調(diào)節(jié)。

LAG-3在CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞、TCRαβCD8αα上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、γδT細(xì)胞和NKT細(xì)胞上也有表達(dá),據(jù)報道,其在活化NK細(xì)胞上的表達(dá)參與了對小鼠MHCI陰性靶細(xì)胞的殺傷作用。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和活化B細(xì)胞也在其細(xì)胞表面表達(dá)LAG-3。然而,LAG-3在這些細(xì)胞中的功能作用仍然知之甚少。此外,據(jù)報道LAG-3在神經(jīng)元上也有表達(dá),并作為α-突觸核蛋白纖維的受體。

LAG-3的配體

最近,MHCII反式激活因子(CIITA)被確定為LAG-3配體的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。CIITA不僅誘導(dǎo)MHCII表達(dá),還誘導(dǎo)MHCII輔助分子表達(dá),包括CD74和H2-DM。MHCII的輔助分子有助于肽MHCII復(fù)合物(pMHCII)的形成和細(xì)胞表面分類,在傳統(tǒng)的抗原呈遞途徑中表現(xiàn)出穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。LAG-3區(qū)分pMHCII的構(gòu)象并選擇性地與穩(wěn)定的pMHCII結(jié)合。因此,LAG-3優(yōu)先抑制識別穩(wěn)定pMHCII的CD4+T細(xì)胞的激活。此外,也已證明LAG-3不與CD4競爭pMHCII結(jié)合。相反,LAG-3通過通過細(xì)胞內(nèi)區(qū)域傳遞抑制信號抑制T細(xì)胞激活。

LAG-3的配體

如前所述,LAG-3表達(dá)于腫瘤衰竭的CD8+T細(xì)胞上,是腫瘤免疫治療的有效靶點。然而,LAG-3與pMHCII結(jié)合影響CD8+T細(xì)胞活化的機(jī)制尚未闡明。最近,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗原提呈細(xì)胞除了表達(dá)同源的pMHCI外,還表達(dá)大量穩(wěn)定的pMHCII時,CD8+T細(xì)胞的活化受到弱抑制,這表明LAG-3也可以在一定程度上直接抑制CD8+T細(xì)胞。

到目前為止,除了穩(wěn)定的pMHCII外,還有其他幾種分子被報道為LAG-3的可能配體。如前所述,galectin-3和LSECtin已被證明與LAG-3上的聚糖相互作用。Galectin-3屬于Galectin家族,是一種由多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞分泌的可溶性半乳糖結(jié)合凝集素。LSECtin是C型凝集素家族的一員,主要在肝臟中表達(dá)。研究報道,在表達(dá)LSECtin的黑色素瘤細(xì)胞中,LAG-3抑制T細(xì)胞在抗CD3抗體刺激下產(chǎn)生IFN-γ。最近,Wang等人發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)是LAG-3的潛在配體。FGL1在正常生理條件下由肝細(xì)胞分泌,而一些腫瘤細(xì)胞也能高水平地產(chǎn)生FGL1。FGL1被證明可以使表達(dá)LAG-3的3A9 T雜交瘤細(xì)胞減少IL-2的分泌。還需要進(jìn)一步的研究來闡明這些潛在配體是否以及如何獨立和/或協(xié)同地參與LAG-3的抑制功能。

除了免疫抑制作用外,LAG-3似乎在神經(jīng)系統(tǒng)中也有明顯的作用。Mao等人報道LAG-3可以與α-突觸核蛋白纖維結(jié)合,這與帕金森病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。α-突觸核蛋白纖維與LAG-3的結(jié)合觸發(fā)了α-突觸核蛋白纖維的內(nèi)吞作用、細(xì)胞間傳遞和神經(jīng)毒性。

LAG-3的抑制機(jī)制

LAG-3的胞內(nèi)區(qū)由大約60個氨基酸殘基組成,缺乏典型的抑制基序,如免疫受體基于酪氨酸的抑制基序。然而,它包含幾個氨基酸序列,這些氨基酸序列在不同的LAG-3物種中非常保守,而不與其他抑制性共受體共享。這些序列包括并列膜區(qū)的FSAL,中部區(qū)域的KIEELE,10-15個谷氨酸串聯(lián)重復(fù)序列,以及在C末端區(qū)域的傾向但不限于的脯氨酸(EX-repeat)。LAG-3抑制T細(xì)胞活化需要細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的信號傳遞,它可以通過這些序列傳遞不同的抑制信號。

LAG-3的抑制功能與其在細(xì)胞表面的表達(dá)水平密切相關(guān),當(dāng)評估小鼠LAG-3突變體在DO11．10t雜交瘤細(xì)胞抗原依賴性激活中的表達(dá)水平時,氨基酸替換和缺失對LAG-3的表達(dá)水平有顯著影響,FSAL序列中苯丙氨酸和亮氨酸被丙氨酸取代后,LAG-3的抑制能力顯著降低。此外,當(dāng)FSAL序列的突變與EX-repeat的缺失相結(jié)合時,LAG-3的抑制能力完全喪失,相當(dāng)于缺少了整個細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。有趣的是,EX-repeat的缺失并不影響LAG-3的抑制能力。這些結(jié)果表明LAG-3可能通過FSAL基序和EX-repeat轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個獨立的抑制信號,然而這些信號的分子機(jī)制仍不清楚。進(jìn)一步的分析有望描繪出這些基序獨立或協(xié)同調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化信號通路的精確分子機(jī)制。

LAG-3在自身免疫中的作用

抑制性共受體在建立和/或維持自身免疫耐受中起著關(guān)鍵作用,其表現(xiàn)為PD-1和CTLA-4缺陷小鼠自發(fā)的自身免疫性疾病,靶向PD-1和CTLA-4的免疫檢查點抑制劑不僅激活腫瘤特異性T細(xì)胞,還激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞,以誘導(dǎo)組織毒性,稱為irAEs。與PD-1和CTLA-4不同,LAG-3缺陷本身不會導(dǎo)致非自身免疫傾向小鼠的自身免疫。然而,在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中,LAG-3的基因缺失或阻斷會加重1型糖尿病(T1D)。LAG-3缺陷NOD小鼠與年齡匹配的LAG-3豐富的NOD小鼠相比,胰島中自身反應(yīng)性CD4+和CD8+T細(xì)胞加速浸潤。此外,LAG-3和PD-1復(fù)合缺陷小鼠會發(fā)生致命性自身免疫性心肌炎,表明LAG-3與PD-1協(xié)同作用,以預(yù)防自身免疫。

在實驗性自身免疫模型中,LAG-3被報道可以減輕自身免疫癥狀。Jha等報道LAG-3缺乏或阻斷通過抑制C57BL/6．H2s小鼠對汞的耐受性,增加了對汞誘導(dǎo)的自身免疫的易感性。在髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)誘導(dǎo)的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型中,kadovaki等人證明LAG-3阻斷劑消除了腸道環(huán)境誘導(dǎo)的上皮內(nèi)MOG特異性CD4+T細(xì)胞的抗炎作用。Kim等還報道了體外誘導(dǎo)的Treg(iTreg)細(xì)胞拯救Treg耗竭小鼠致死EAE的能力依賴于iTreg細(xì)胞上LAG-3的表達(dá)。

鑒于LAG-3在自身免疫中的重要調(diào)節(jié)作用,LAG-3有望成為炎癥和自身免疫性疾病的治療靶點。已開發(fā)出具有ADCC活性的人源化抗LAG-3抗體(GSK2831781),通過清除可能包括致病性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的LAG-3+T細(xì)胞來治療自身免疫性疾病。此外,抗LAG-3激動劑抗體(IMP761)通過誘導(dǎo)LAG-3的抑制作用,在體內(nèi)外均有免疫抑制作用。

LAG-3在抗腫瘤免疫中的作用

如前所述,LAG-3在衰竭的CD4+和CD8+腫瘤浸潤性T細(xì)胞上表達(dá),這些T細(xì)胞在黑色素瘤、結(jié)直腸癌患者的外周血和腫瘤組織中也有表達(dá),這種表達(dá)LAG-3的Treg細(xì)胞產(chǎn)生高水平的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β,并抑制腫瘤特異性T細(xì)胞。一直以來,腫瘤中LAG-3表達(dá)水平和LAG-3+細(xì)胞浸潤與腫瘤進(jìn)展、預(yù)后不良和各種類型的人類腫瘤相關(guān)。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明,LAG-3參與了類似PD-1的腫瘤免疫逃逸機(jī)制。因此,LAG-3被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的一個有前途的治療靶點,動物模型的研究也證實了這一點。抗LAG-3抗體延緩腫瘤生長的研究已在HNSCC和纖維肉瘤的小鼠模型中被報道。Grosso等人證明,結(jié)合抗LAG-3抗體和接種腫瘤相關(guān)抗原的組合療法增加了腫瘤中活化的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量,并在前列腺癌的腫瘤耐受模型中破壞了腫瘤實質(zhì)。然而,在聯(lián)合治療或單獨接種的小鼠之間,腫瘤等級沒有顯著差異。

LAG-3與PD-1協(xié)同抑制抗腫瘤免疫和自身免疫。在上皮性卵巢癌患者中,Matsuzaki等人觀察到大約80%佛如LAG-3+和50%的LAG-3-腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1。他們還報道了LAG-3和PD-1的聯(lián)合阻斷增強(qiáng)了腫瘤相關(guān)抗原NY-ESO-1體外刺激腫瘤浸潤的CD8+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在B16黑色素瘤、MC38結(jié)腸腺癌、Sa1N纖維肉瘤和復(fù)發(fā)性黑素瘤等多種腫瘤模型中也觀察到LAG-3和PD-1在腫瘤浸潤的CD4+、CD8+T細(xì)胞上的共表達(dá)以及LAG-3和PD-1基因復(fù)合缺失的強(qiáng)治療作用。盡管LAG-3阻斷劑有望激活腫瘤特異性CD4+和/或CD8+T細(xì)胞,但它也可能增加Treg細(xì)胞的數(shù)量,LAG-3被報道可以限制Treg細(xì)胞的增殖。根據(jù)Goding等人的研究,在復(fù)發(fā)性黑色素瘤模型中,Treg細(xì)胞被LAG-3和PD-1共同阻斷而減少。還需要進(jìn)一步的研究來闡明LAG-3對Treg細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和功能的確切影響。

在這些研究中,抗LAG-3ab作為單藥治療時產(chǎn)生了一定的治療效果,但顯著增強(qiáng)了抗PD-1抗體的治療效果。這兩種分子的抑制機(jī)制和/或表達(dá)譜的差異很可能解釋了它們的功能協(xié)同作用。LAG-3與PD-1協(xié)同或加性作用的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

LAG-3的臨床開發(fā)

基于臨床前的觀察,尤其是與針對PD-1的藥物聯(lián)合使用帶來的益處。到目前為止,已經(jīng)開發(fā)出至少13種針對LAG-3的藥物。包括抗LAG-3阻斷性抗體(relatlimab(BMS-986016)、Sym022、TSR-033、REGN3767、LAG525、INCAGN2385-101、MK-4280和BI754111)以及拮抗雙特異性抗體(MGD013(抗PD-1/LAG-3)、FS118(Anti-LAG-3/PD-L1)和XmAb22841 (anti-CTLA-4/LAG-3))。

到目前為止,只有少數(shù)針對LAG-3和PD-1的組合療法的中期報告�？筁AG-3抗體作為單藥治療的實際療效或抗LAG-3抗體在PD-1和LAG-3聯(lián)合治療中的確切加性效應(yīng)有待進(jìn)一步的報道。在I/II期研究中(NCT0198609),評估了relatlimab聯(lián)合抗PD-1抗體(nivolumab)治療晚期黑色素瘤患者的安全性和有效性,這些患者在先前的抗PD-1或抗PD-L1免疫治療中有進(jìn)展,relatlimab與nivolumab聯(lián)合應(yīng)用耐受性良好,61例患者的客觀緩解率(ORR)為11．5%。腫瘤邊緣內(nèi)至少1%的腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中LAG-3表達(dá)的患者(n=33)的ORR至少比LAG-3表達(dá)低于1%的患者(n=22)高3．5倍(分別為18%和5%)。在I/II期研究(NCT02460224)中,LAG525聯(lián)合抗PD-1抗體(spartalizumab)在9．9%的患者中(n=121)表現(xiàn)出持久的反應(yīng),包括間皮瘤(8例患者中的2例)和三陰性乳腺癌(5例中有2例)。這種抗LAG-3抗體的確切作用機(jī)制仍有待研究。尤其是對抗LAG-3治療中靶細(xì)胞的檢測以及闡明抗LAG-3和抗PD-1治療協(xié)同作用的機(jī)制,是合理設(shè)計療效最大、副作用最小的抗LAG-3治療方案所必需的。

其他LAG-3靶向藥物也被用于癌癥治療。IMP321是一種可溶性重組融合蛋白,由LAG-3的胞外區(qū)和IgG的Fc區(qū)組成,通過MHCII介導(dǎo)反向信號激活抗原提呈細(xì)胞,導(dǎo)致IL-12和TNF的增加,CD80和CD86的上調(diào)。在目前進(jìn)行的臨床試驗中,IMP321單藥治療或與其他療法聯(lián)合治療的療效一般。通過MHCII反向信號的細(xì)節(jié)仍然未知,需要仔細(xì)研究。

抗-LAG-3消耗抗體(GSK2831781)和激動劑抗體(IMP761)作為治療自身免疫性疾病的潛在治療劑也有報道。盡管這些抗體旨在清除或抑制致病性T細(xì)胞,但它們也可能消耗或抑制Treg細(xì)胞。進(jìn)一步的研究闡明這種抗體的功能以及LAG-3的生物學(xué)特性有望促進(jìn)其發(fā)展。

展望

靶向抑制性協(xié)同受體PD-1和CTLA-4的檢查點免疫療法徹底改變了癌癥治療,而LAG-3作為新一代發(fā)現(xiàn)的抑制性檢查點,有望成為腫瘤治療中極具前景的靶點。然而,我們對LAG-3的理解仍然非常有限,許多基本問題仍然沒有得到解答。LAG-3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚,其配體也很復(fù)雜。LAG-3在多種細(xì)胞中表達(dá),然而,LAG-3的功能以及LAG-3阻斷劑在每種類型細(xì)胞中的作用尚未闡明。我們還需要研究LAG-3和其他共受體的功能差異、冗余和協(xié)同作用。通過更詳細(xì)地闡明LAG-3的功能特性,我們才可以合理地設(shè)計LAG-3靶向治療各種疾病,如癌癥和自身免疫疾病。

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