Sanger雙脫氧鏈終止法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見DNA堿基序列的一種方法。

一代測序結(jié)果圖，橫軸是電泳時間，縱軸是熒光強度，橫軸也是堿基的先后次序。峰越高、越尖，與別的峰交錯越少，則這個堿基判讀準確性越好。結(jié)果肉眼可見，直觀而準確。

二代測序：第二代DNA測序技術(shù)又稱高通量測序技術(shù)（High－throughput sequencing， HTS），以低成本、較高的準確度，一次可對幾百、幾千個樣本的幾十萬至幾百萬條DNA分子同時進行快速測序分析。這一時期的代表技術(shù)有 Roche公司的454（已退市）、Illumina公司的Solexa（已升級到Novaseq，市場份額第一）和ABI公司的SOLID（由ThermoFisher公司收購，已升級到Ion Torrent S5），由于該時期的測序技術(shù)十分前沿，因而市場主要被這三家公司所壟斷。其測序技術(shù)復(fù)雜，生成測序文件數(shù)據(jù)量巨大，后續(xù)生物信息處理難度高，因此近5年才逐步進入臨床，且多用于腫瘤精準用藥的部分。

以illumina為例，我們簡單介紹一下其測序流程。

①將目的DNA分子打斷成100－200 bp的片段，隨機連接到固相基質(zhì)上，經(jīng)過Bst聚合酶延伸和甲酸胺變性的橋PCR循環(huán)，生成大量的DNA簇（DNA cluster），每個DNA 簇中約有超過1000個相同序列的DNA片段。

②之后的反應(yīng)與Sanger法類似，加入用4種不同熒光標記并結(jié)合了可逆終止劑的dNTP。固相基質(zhì)上每個孔有八道獨立檢測的位點，所以一次可以并行八個獨立文庫，可容納數(shù)百萬的模版克隆，可把多個樣品混合在一起檢測，每個固相基質(zhì)上一次可讀取10億個堿基。

③DNA簇與單鏈擴增產(chǎn)物的通用序列雜交，由于終止劑的作用，DNA聚合酶每次循環(huán)只延伸一個dNTP。每次延伸所產(chǎn)生的光信號被標準的微陣列光學(xué)檢測系統(tǒng)分析測序，下一次循環(huán)中把終止劑和熒光標記基團裂解掉，然后繼續(xù)延伸dNTP，實現(xiàn)了邊合成邊測序技術(shù)。

④其主要的缺點是由于光信號衰減和移相的原因使得序列讀長較短，可以進行每個DNA測序片段的閱讀長度較短，目前主流且成本最低的就是做雙端測序150bp（PE150）。我們測全外顯子組的策略也是PE150。

二代測序原理，通過簇生成，CCD捕獲結(jié)合到模板的dNTP發(fā)的熒光，確定其DNA序列。

二代測序完成后，由于數(shù)據(jù)量巨大，復(fù)雜和多樣，因此，結(jié)果是肉眼不可見的，需要專業(yè)的算法、流程將原始數(shù)據(jù)處理為可用的數(shù)據(jù)。可比喻為，測序只是去菜場買菜，算法則是把菜做成大餐的過程。這個過程需要超級計算機，建立好的優(yōu)秀算法以及精通生物信息學(xué)分析的人員。

二代測序分析流程中，需要將原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控后生成一系列的中間文件（左圖），通過繁瑣的生物信息學(xué)流程（中圖），最后拼接成我們想要的基因。目前全流程多用Python和Perl語言在服務(wù)器上實現(xiàn)（右圖）。

二代測序由于其原理的一些問題，導(dǎo)致必須同一個位點測多次，才能保證數(shù)據(jù)的可靠性。一般用于臨床的數(shù)據(jù)，需要同一位點測序后出現(xiàn)200次以上。我們將這樣的方案叫做測序深度（＞200 X）。二代測序的優(yōu)勢是巨大的，其數(shù)據(jù)量巨大，可短時間高效率對人類基因組測序，并發(fā)現(xiàn)大量未知位點。單個位點成本降低，是個性化醫(yī)療和精準用藥的基礎(chǔ)。

最后，還有一種類似測序的工具，叫做基因芯片�；�因芯片的原型是80年代中期提出的�；�因芯片的測序原理是雜交測序方法。目前由國內(nèi)外幾家大廠家所壟斷。其優(yōu)點是信息量較大，比一代測序的識別位點極大提升，可批量化生產(chǎn)并有完全標準流水線工作。但其缺點也很明顯，成本仍較高，無技術(shù)門檻，只檢測已選擇好的位點，更新位點的時間和經(jīng)費成本較高。比如illunima公司的ASA芯片，就是在一塊芯片上集成了66萬個人類基因組位點，檢測信息量大約30m左右。

2001年，通過一代測序，耗資37億美元，耗時13年，獲得了人類基因組草圖。到了2007年，用二代測序完成第一個完整的人類基因組序列圖譜只花費了150萬美元，耗時3個月。到了2020年，人類基因組測序只需要不到1萬元人民幣即可完成測序工作，時間只需要3天。近年來，測序技術(shù)突飛猛進，隨著測序單價的不斷降低，我們必將見證人人都有“基因身份證”的那一天。